人脐带间充质干细胞诱导为脂肪细胞的研究

发布时间：2017-04-21 14:08

  本文关键词：人脐带间充质干细胞诱导为脂肪细胞的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究目的：间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)是一类较原始的干细胞,具有高度增殖性和多向分化潜能。目前研究较多的是骨髓间充质干细胞,而脐带间充质干细胞近几年才被人们重视并加以研究。与骨髓间充质干细胞相比,脐带间充质干细胞不仅具有相似的增殖特性及多向分化潜能,而且具有取材方便、来源广泛、免疫原性更低等优势,这是其成为近年来干细胞研究领域中的热点。本研究建立了分离纯化人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell, hUC-MSC)的方法,并对其表面标志进行了鉴定。同时研究间充质干细胞向脂肪细胞的诱导分化,并探讨其分化过程中miRNA-27a和miRNA-143的表达,为阐述间充质干细胞脂向分化的调控机制提供了新的思路,并有一定的临床应用价值。 研究方法：在严格无菌条件下,采集健康足月胎儿的脐带组织,采用酶消化法和组织块贴壁法进行原代细胞分离培养,通过流式细胞仪对其表面标记进行检测。将原代细胞进行传代培养,并将第5代间充质干细胞经IBMX、胰岛素、吲哚美辛和地塞米松联合使用进行脂向诱导。利用油红O免疫组化染色的方法鉴定分化后的细胞,使用实时荧光定量PCR技术比较间充质干细胞和脂肪细胞中miRNA-27a和miRNA-143以及它们靶基因的表达。随后分析miRNA-27a和miRNA-143以及它们对应靶基因的变化趋势。 研究结果：分离纯化后的hUC-MSCs呈均匀有序的成纤维细胞形态。脐带酶消化法培养的细胞2-3天可见成纤维样细胞,3-5天后在倒置显微镜下可见散在分布的细胞集落,贴壁后的细胞增殖速度较快,原代细胞培养5天后可见大量细胞,融合度达80%。使用组织块培养法,5-7天可见脐带组织块周围有细胞爬出,爬出的细胞随后贴壁生长,呈短粗梭型或多角形。贴壁后的细胞增殖速度快,2周左右细胞可达80-90%融合。两种方法下,当细胞达到80-90%的融合度时,按1：3的比例进行传代,传代后细胞生长3-6小时便可贴壁,最初为短粗的梭形或者卵圆形,24小时后细胞变为长梭形或多边形,细胞均匀分布,平行排列生长或旋涡状生长,约3天可达到80%融合。取第5代脐带间充质干细胞进行流式细胞术检测细胞表面标记物,结果显示hUC-MSCs高表达CD44、CD73、 CD105、CD166、HLA-ABC,不表达cD34、CD106,符合间充质干细胞的生物学特性。在将其定向诱导为脂肪细胞的过程中,利用吲哚美辛、地塞米松、胰岛素以及3-异丁基-1-甲基黄嘌呤四种诱导剂可以使脐带间充质干细胞分化为脂肪细胞的效率达到90%以上,且绝大多数为油红O染色阳性的成熟脂肪细胞。利用实时荧光定量PCR检测证实miRNA-27a在MSCs脂向分化的过程中显著下调(0.0095±0.002vs1±0.03)；miRNA-143的相对表达量则显著上调(17.81±0.88vs1±0.004)。 结论：该研究证实采用酶消化法和组织块法均能分离得到人脐带间充质干细胞,且均具有高度的增殖能力,流式细胞仪检测符合间充质干细胞的生物学特性。在体外利用吲哚美辛、地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤四种诱导剂可以使脐带间充质干细胞分化为脂肪细胞。在诱导分化过程中,miRNA-27a和miRNA-143的相对表达量发生变化,提示miRNA-27a和miRNA-143可能参与MSCs的脂向分化过程。本研究为促进脂肪组织工程的发展及软组织损伤修复与重建的临床应用,以及为肥胖、糖尿病等代谢性疾病的诊断和治疗带来了全新的思路和视角。
【关键词】：脐带间充质干细胞 脂向分化 脂肪细胞 miRNA 实时荧光定量 PCR
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-14
• 研究现状、成果11-13
• 研究目的、方法13-14
• 一、脐带间充质干细胞分离、培养和纯化14-23
• 1.1 对象和方法14-17
• 1.1.1 对象14
• 1.1.2 主要仪器和设备14
• 1.1.3 主要试剂及配置14-15
• 1.1.4 UC-MSCs的分离培养15-16
• 1.1.5 UC-MSCs的体外扩增16
• 1.1.6 形态学观察16-17
• 1.1.7 流式细胞仪检测UC-MSCs的表面标志17
• 1.2 结果17-21
• 1.2.1 UC-MSCs形态学及生长特点17
• 1.2.2 UC-MSCs流式细胞仪检测17-21
• 1.3 讨论21-22
• 1.3.1 脐带间充质干细胞的分离培养21-22
• 1.3.2 脐带间充质干细胞的鉴定22
• 1.4 小结22-23
• 二、脐带间充质干细胞定向诱导为脂肪细胞23-33
• 2.1 对象和方法23-26
• 2.1.1 主要仪器和设备23
• 2.1.2 主要试剂及配置23
• 2.1.3 UC-MSCs诱导为脂肪细胞23-24
• 2.1.4 油红O染色24
• 2.1.5 细胞RNA提取24
• 2.1.6 qRT-PCR检测脂肪细胞中miRNA的表达24-26
• 2.2 结果26-30
• 2.2.1 成脂诱导及油红O染色26
• 2.2.2 miR-27a与靶基因PPARγ在诱导分化的脂肪细胞中的表达变化26-27
• 2.2.3 miR-143与靶基因ERK5在诱导分化的脂肪细胞中的表达变化27-30
• 2.3 讨论30-31
• 2.3.1 UC-MSCs诱导为脂肪细胞30
• 2.3.2 miRNA与脂肪细胞30-31
• 2.4 小结31-33
• 结论33-34
• 参考文献34-36
• 发表论文和参加科研情况说明36-37
• 综述37-51
• 综述参考文献46-51
• 致谢51

【参考文献】

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本文编号：320496