miRNAs在变性真皮及热损伤成纤维细胞/HUVECs中表达及功能的研究

发布时间：2021-05-23 14:30

　　目的采用基因芯片的方法筛选烧伤患者变性真皮较正常皮肤中差异表达的miRNAs,然后预测其靶基因以及对变性真皮可能起保护作用的信号通路；挑选出在细胞增殖和迁移中发挥重要作用的miR-199a-5p及miR-126,检测其在大鼠变性真皮中的表达规律；深入研究miR-199a-5p在热损伤成纤维细胞、miR-126在热损伤人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）转归中的作用,并探讨其可能的机制。方法1.收集深二度烧伤患者的变性真皮及配对正常皮肤,标本收集时间均为患者烧伤后第四天,采用高通量miRNA芯片技术初步筛选出变性真皮较正常皮肤差异表达的miRNAs。在另一组标本中应用QRT-PCR技术检测部分差异表达的miRNAs,验证芯片结果的准确性。使用生物信息学方法预测其靶基因以及对变性真皮可能起保护作用的信号通路。筛选出与芯片结果一致并且在细胞增殖和迁移中发挥重要作用的miRNAs （miR-199a-5p和miR-126）进行下一步实验。2.建立大鼠深二度烫伤模型,检测miR-199a-5p和miR-126在大鼠变性真皮恢复不同时间（烫伤后1天、3天、5天、7天、14天）的表达情况,以大鼠正常... 

【文章来源】：中南大学湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：119 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
目录
英文缩写词表
引言
第一章 深度烧伤患者变性真皮中miRNAs的表达变化及功能预测
    摘要
    Abstract
    前言
    材料与方法
        1. 主要试剂及器材
            1.1 miRNA芯片
            1.2 其它主要试剂
            1.3 主要仪器
            1.4 主要试剂的配制
        2. 方法
            2.1 烧伤患者变性真皮组织的收取
            2.2 组织切片及HE染色
            2.3 miRNA芯片技术检测烧伤患者变性真皮中miRNAs的表达
            2.4 miRNA的逆转录
            2.5 miRNA的QRT-PCR
            2.6 miRNA引物序列
            2.7 靶基因预测及信号通路分析
            2.8 统计学分析
    结果
        1. 研究对象的相关资料
        2. 变性真皮的组织病理学检查
        3. 芯片检测烧伤患者变性真皮miRNA表达的变化
        4. 对烧伤患者变性真皮与正常皮肤差异表达miRNAs的验证
        5 靶基因预测及信号通路分析
    讨论
第二章 miR-199a-5p在热损伤成纤维细胞转归中的表达及作用
    摘要
    Abstract
    前言
    材料与方法
        1. 主要试剂及器材
            1.1 试剂及材料
            1.2 主要仪器
            1.3 主要试剂配制
        2. 大鼠深二度烫伤
            2.1 深二度烫伤模型的制作
            2.2 动物分组
            2.3 标本采集及处理
        3 原代成纤维细胞的培养
            3.1 原代皮肤成纤维细胞的分离和体外培养
            3.2 细胞传代
            3.3 细胞的冻存
            3.4 细胞的复苏
            3.5 细胞计数
        4. 成纤维细胞热损伤模型的制作
        5. 组织及细胞miRNA的提取(使用Rneasy mini kit)
        6. MTT法
        7. 细胞划痕实验
        8. Transwell迁移实验
        9. miRNA转染
    实验结果
        1. miR-199a-5p在大鼠变性真皮中的表达
            1.1 大鼠深二度烫伤模型
            1.2 miR-199a在大鼠变性真皮中的表达
        2. 成纤维细胞的热损伤预处理
            2.1 成纤维细胞的热损伤模型
            2.2 成纤维细胞热损伤后miRNA-199a-5p的表达
        3. miRNA-199a-5p mimics和miRNA-199a-5p inhibitors转染成纤维细胞
        4. miRNA-199a-5p对热损伤成纤维细胞增殖能力的影响
        5. miRNA-199a-5p对热损伤成纤维细胞迁移能力的影响
            5.1 划痕试验
            5.2 transwell
        6. miRNA-199a-5p的靶基因预测及筛选
    讨论
第三章 miR-126在热损伤HUVECs转归中的作用
    摘要
    Abstract
    前言
    材料与方法
        1. 主要试剂及器材
            1.1 试剂及材料
            1.2 主要仪器
            1.3 miRNA mimics 及 miRNA inhibitors 的配制
        2. 大鼠深二度烫伤
            2.1 深二度烫伤模型的制作
            2.2 动物分组
            2.3 标本采集及处理
        3. 原代HUVECs的培养
            3.1 原代HUVECs的培养
            3.2 细胞传代、细胞冻存、细胞复苏、细胞计数
        4. HUVECs热损伤模型的制作
        5. 组织及细胞miRNA的提取(使用Rneasy mini kit)
        6. miRNA转染
    实验结果
        1. miR-126在大鼠变性真皮中的表达
        2. HUVECs的热损伤预处理
            2.1 HUVECs的热损伤模型
            2.2 HUVECs热损伤后miRNA-126的表达
        3 miRNA-126 mimics和miRNA-126 inhibitors转染HUVECs
        4. miRNA-126对热损伤HUVECs增殖能力的影响
        5. miRNA-126对热损伤HUVECs迁移能力的影响
            5.1 划痕试验
            5.2 transwell
        6. miRNA-126的靶基因预测及筛选
    讨论
全文结论
参考文献
综述
    参考文献
博士期间的研究成果
    一：参与科研情况
    二：论文发表情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]人脐带与骨髓来源间充质干细胞miRNA的差异表达[J]. 张芳,陈学斌,盛望.  北京工业大学学报. 2011(10)
[2]miR-199a-3p对前列腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响[J]. 孔繁飞,王中显,孙朝阳,吕煊,翁丹卉,卢运萍,陈刚,吴明富.  肿瘤防治研究. 2011(08)
[3]保留变性真皮大张自体皮移植的病理观察[J]. 范鹏举,黄晓元,杨兴华,张丕红.  中南大学学报(医学版). 2008(07)
[4]离体人皮肤成纤维细胞热损伤后转归的形态学观察[J]. 李德全,黄晓元,杨兴华.  中国组织工程研究与临床康复. 2008(11)
[5]HSP90在离体人真皮成纤维细胞热损伤中的保护作用[J]. 李德全,黄晓元,龙剑虹,杨兴华.  第四军医大学学报. 2008(04)
[6]成纤维细胞生物学特性与创伤修复的研究进展[J]. 匡新建,陈伟高.  实用诊断与治疗杂志. 2005(12)
[7]CCN蛋白家族研究进展[J]. 焦园园,杨桂文,安利国,叶棋浓.  山东师范大学学报(自然科学版). 2005(03)
[8]大鼠深Ⅱ度烧伤创面保留变性真皮并覆盖自体皮疗效观察[J]. 刘英,黄晓元,杨兴华.  中华烧伤杂志. 2005(01)
[9]保留变性真皮并移植大张自体皮修复手部深度烧伤的远期疗效观察[J]. 杨兴华,黄晓元,雷少榕,张丕红,张明华,肖目张,曾纪章,龙剑虹.  中华烧伤杂志. 2005(01)
[10]变性真皮与自体皮复合移植修复手部深度烧伤[J]. 黄晓元,杨兴华,雷少榕,肖目张,张明华,曾纪章.  中华烧伤杂志. 2001(01)



本文编号：3202699