Slit2蛋白对TNF-α诱导的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖迁移的影响及其机制探讨

发布时间：2017-04-22 21:08

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【摘要】：1984年，Nusslein-Volhard等[1]在果蝇体内发现了分泌型细胞外基质蛋白Slit，分子量约为200kD，Slit家族在哺乳动物体内有3种亚型：Slit1、Slit2、Slit3，其中Slit1只存在于神经系统[2],而Slit2、Slit3还可表达在神经系统外,如肺、肾、肝脏、乳腺、心脏，视网膜等[3,4,5,6]。Slit的主要结构包括N端串联的4个富含亮氨酸的重复区（leucine-rich repeats/LRRs,D1-D4），7-9个表皮生长因子重复序列（EGF repeats），1个层粘连蛋白G-样区域(laminin G-like domain)和1个C末端的半胱氨酸结（cystein knot）[7]。Slit的表皮生长因子区域能水解释放出一个长的Slit-N端和一个短的Slit-C端，其中Slit-N端有活性，能调节其与单通道跨膜受体Robo的结合，而Slit-C端无生物学活性[8]。 已证实在神经系统Slit-Robo能阻止纵向神经元进入中线，在下丘脑-垂体-性腺轴形成上也有作用[9]；在炎症反应中，Slit-Robo能阻止趋化因子CXCL12/CXCR4介导的T细胞和巨噬细胞趋化[10]；在肿瘤组织中，能通过影响细胞周期影响肿瘤组织的生长，将Slit2蛋白注入裸鼠体内，抗凋亡因子Bcl-xl和增值相关周期蛋白Cdk6、Cyclin D1降低[11]，肝癌细胞增殖率降低[12]；在心血管系统中，Slit-Robo影响心肌细胞迁移，降低上皮钙粘连蛋白的活性，从而影响早期心脏管腔形成及血管重建[13,14]。近年来LIU等发现外源性Slit2蛋白对血管平滑肌细胞（vascular smooth musclecells，VSMCs）的生长没有明显作用，但能以浓度依赖的方式通过影响RAC1蛋白（Rho家族的GTP酶，Rho GTP ases）的活性阻止血小板源性生长因子（Platelet Derived Growth Factor，PDGF）介导的人主动脉VSMCs迁移[4]。在Slit家族中，Slit2是研究最多的一个亚型。Morlot等发现Slit2D4（第四亮氨酸重复区）能利用保守基序在其凹面形成二聚体，同时能与硫酸乙酰肝素结合[15]，增强Slit2第二亮氨酸重复区与Robo的结合。Slit2-Robo1被证明是白细胞趋化的内源性抑制因子，在炎症反应中能抑制中性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞的迁移[16,17]。将Slit2蛋白通过尾静脉注射至AopE-/-（载脂蛋白E缺失）小鼠，血清中HDL升高，动脉斑块面积缩小，提示Slit2蛋白的过表达可能抑制动脉粥样硬化的发生发展[18]。 肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis FactorAlpha,TNF-α）是一种重要的炎症介质，可促进平滑肌细胞增生及迁移，参与冠状动脉粥样硬化的形成和发展。在人恶性黑色素瘤细胞（A375），TNF-α能上调Slit2mRNA的表达[19]。因此我们筛选Slit2作为研究对象，观察在TNF-α作用下，Slit2-Robo对VSMCs增殖及迁移的影响。目前国内外关于TNF-α与Slit2-Robo信号通路的研究尚未见报道，我们通过体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞，检测Slit2在平滑肌细胞上的表达和在TNF-α刺激下的表达及分泌情况，观察Slit2-Robo信号通路对平滑肌细胞增殖及迁移的影响，探讨其可能的作用机制，为今后研究Slit-Robo信号通路在动脉粥样硬化中的作用提供实验依据。 目的：1.检测大鼠胸主动脉VSMCs上Slit2mRNA及Slit2蛋白的表达。2.了解炎症因子TNF-α对VSMCs增殖迁移的作用及其对Slit2蛋白表达的影响。3.观察Slit2-Robo信号通路对VSMCs增殖迁移的影响，探讨其可能的作用机制。 方法：1.贴壁法培养大鼠胸主动脉VSMCs。2.免疫荧光技术检测平滑肌细胞Slit2蛋白的表达，RT-PCR检测Slit2mRNA的表达[20]。3.大鼠VSMCs分为正常对照组和实验组，正常对照组：无添加TNF-α的细胞悬液；实验组分别含有TNF-α（0.01、0.1、1、10、100ng/ml）各5个不同浓度的细胞悬液组。CCK-8及Transwell实验检测各组细胞悬液对大鼠VSMCs增殖及迁移的影响；real-time PCR技术检测各组细胞Slit2mRNA的表达，ELISA技术检测培养液中Slit2蛋白的分泌。4.大鼠VSMCs分为正常对照组及试验组，正常对照组：无添加Slit2的细胞悬液；实验组：分别含有Slit2蛋白(50、75、100、125、150ng/ml)各5个不同浓度的细胞悬液。CCK-8及transwell实验检测及两组细胞悬液对VSMCs增殖迁移的影响。5.大鼠VSMCs分为正常对照组、阳性对照组及试验组，正常对照组：无添加Slit2和TNF-α的细胞悬液；阳性对照组：含10ng/ml TNF-α的细胞悬液；实验组：分别含10ng/ml TNF-α及Slit2蛋白(50、75、100、125、150ng/ml）各5个不同浓度的细胞悬液。CCK-8及transwell实验检测各组细胞悬液对大鼠VSMCs增殖迁移的影响。6.大鼠VSMCs分为正常对照组：无添加Slit2蛋白及TNF-α的细胞悬液；TNF-α组：含浓度10ng/ml TNF-α的细胞悬液；Slit2组：含浓度100ng/ml Slit2的细胞悬液；TNF-α+Slit2组：含10ng/ml TNF-α+100ng/ml Slit2的细胞悬液。Werstern Blot及real-time PCR检测各组RAC1蛋白及基因的表达。 结果：1.从培养的VSMCs提取总RNA，经RT-PCR扩增出Slit2mRNA，Slit2免疫荧光染色显示VSMCs胞质呈阳性。2.增殖实验中试验组与对照组相比，OD值升高，差异有统计学意义P0.05），TNF-α浓度10ng/ml时作用最明显；迁移试验中TNF-α浓度1、10、100ng/ml组与正常对照组迁移细胞数目比较差异有统计学意义P0.05）,TNF-α浓度10ng/ml时作用最明显，，而TNF-α浓度0.01，0.1ng/ml组与正常对照组迁移细胞数目比较差异无统计学意义（P0.05）。Real-time PCR显示实验组与正常对照组相比，Slit2mRNA表达升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；同时ELISA显示OD值升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，1ng/mlTNF-α导致的Slit2mRNA和Slit2蛋白水平达顶峰。3. Slit2对VSMCs增殖迁移的影响：实验组与对照组OD值及迁移细胞数目比较差异均无统计学意义（P0.05）。4. Slit2对TNF-α诱导的VSMCs增殖迁移的影响：实验组、阳性对照组、正常对照组三组之间细胞迁移数目比较有统计学意义（P0.05）；CCK-8结果显示实验组、阳性对照组与正常对照组OD值比较差异有统计学意义（P0.05），而实验组与阳性对照组OD值比较差异无统计学意义（P0.05）。5. RAC1蛋白的检测：TNF-α组、TNF-α+Slit2组与正常对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；TNF-α组与TNF-α+Slit2组比较有显著差异（P0.01），而Slit2组与正常对照组比较差异没有统计学意义（P0.05）。 结论：1.培养的大鼠VSMCs上有Slit2蛋白表达。2. TNF-α能促进VSMCs的增殖及迁移。3. TNF-α刺激大鼠VSMCs后Slit2mRNA的表达上调，Slit2蛋白的分泌增加，浓度为1ng/ml TNF-α刺激VSMCs后Slit2蛋白的分泌水平达峰值。4. Slit2蛋白可抑制浓度10ng/ml TNF-α诱导的VSMCs迁移，但对VSMCs的增殖无明显作用。5.浓度10ng/ml的TNF-α促进RAC1的表达，浓度100ng/ml的Slit2可抑制浓度10ng/mlTNF-α诱导的RAC1表达。
【关键词】：肿瘤坏死因子-α Slit2 RAC1 血管平滑肌细胞 增殖 迁移
【学位授予单位】：川北医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 致谢4-5
• 摘要5-10
• Abstract10-17
• 第一部分 大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞培养及 SLIT2 蛋白的检测17-32
• 摘要17-18
• Abstract18-19
• 材料与方法19-27
• 结果27-28
• 讨论28-30
• 附图30-32
• 第二部分 TNF-α对血管平滑肌细胞增殖迁移及 SLIT2 表达的影响32-44
• 摘要32-33
• Abstract33-34
• 实验材料与方法34-38
• 结果38-39
• 讨论39-41
• 附图41-44
• 第三部分 SLIT2 对 TNF-α诱导的血管平滑肌细胞增殖迁移的影响44-54
• 摘要44-45
• Abstract45-47
• 实验材料与方法47-48
• 结果48-49
• 讨论49-51
• 附图51-54
• 第四部分 SLIT2 抑制 TNF-α诱导的血管平滑肌细胞迁移的机制探讨54-68
• 摘要54-55
• Abstract55-56
• 材料与方法56-62
• 结果62-63
• 讨论63-66
• 附图66-68
• 结论68-69
• 参考文献69-74
• 综述：SLIT-ROBO 信号传导通路与平滑肌细胞迁移的研究进展74-85
• 参考文献82-85
• 附录85-86
• 个人简历86

【参考文献】

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1 王双,雷小勇;尼群地平对猪主动脉平滑肌细胞增殖的影响[J];衡阳医学院学报;1999年01期

2 方正旭 ,王伶,刘东;关于动脉平滑肌细胞培养的几个问题[J];江西医学院学报;2002年05期

3 梁萍,孙雷,唐建武,王

本文编号：321249