沙门氏菌外膜蛋白的研究

发布时间：2017-04-23 15:01

  本文关键词：沙门氏菌外膜蛋白的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：沙门氏菌属于肠杆菌科，是可引起人畜共患病的革兰氏阴性杆菌。沙门氏菌外膜蛋白可诱导巨噬细胞凋亡，协助细菌具有耐药性，并作为毒力因子在细菌的致病过程中发挥重要作用。本论文通过对甲型副伤寒沙门氏菌四种外膜蛋白基因btuB、mipA、nmpC和pagC的分布进行了初步研究并对编码的外膜蛋白BtuB、MipA、NmpC和PagC的免疫原性进行了评价，此外对mipA基因在鼠伤寒沙门氏菌中的功能进行了探究。 一、btuB、mipA、nmpC和pagC四种基因在肠道细菌中的研究。本实验室在前期研究中通过免疫蛋白质组学筛选到四个具有强免疫原性的外膜蛋白BtuB、MipA、NmpC和PagC，编码四种蛋白的基因分别为btuB、mipA、nmpC和pagC。应用PCR基因扩增技术，检测上述四种基因在141株肠道细菌中的分布情况。结果显示在大肠埃希氏菌和志贺氏菌未携带nmpC和pagC基因，部分沙门氏菌株携带这两种基因，值得注意的是与甲型副伤寒沙门氏菌不同，伤寒沙门氏菌不具有nmpC基因。上述结果为伤寒类疾病的临床诊断及新疫苗研发提供了参考。 二、BtuB、NmpC和PagC外膜蛋白免疫原性的研究。利用阴离子交换法及固化金属离子亲和层析方法对甲型副伤寒沙门氏菌的外膜蛋白NmpC、PagC、his-NmpC和his-PagC进行纯化，获得纯度大于90%的目的蛋白。首先， NmpC和PagC蛋白分别与铝佐剂及壳聚糖结合后，免疫小鼠后检测抗体，结果显示铝佐剂结合组的抗体滴度与壳聚糖结合组并无显著差异；其次，通过与铝佐剂结合，his-BtuB、his-NmpC,和his-PagC联合免疫小鼠后，，发现IgG抗体滴度差异显著；最后， NmpC、PagC、his-NmpC和his-PagC分别与铝佐剂结合后免疫小鼠，实验结果显示，组氨酸标签具有一定的免疫原性，带标签免疫组的抗体滴度与无标签免疫组差异显著。 三、鼠伤寒沙门氏菌mipA基因功能的研究。利用分子生物学技术构建mipA同源突变盒，结合λ-Red噬菌体重组系统，将卡那基因替代鼠伤寒沙门氏菌基因组mipA基因，成功构建了50013△mipA::kan缺失株，50013mipAH互补株,50333△mipA::kan缺失株,50333mipAH互补株。通过血清学实验及生理生化鉴定，结果显示mipA缺失并不影响细菌的表型和生理生化特性；通过毒力评价实验结果显示，mipA基因缺失后50013△mipA::kan缺失株侵袭能力远远大于50013野生株和50013mipAH互补株，mipA过表达株50013mipAH侵袭能力较50013野生株减弱，本实验证明了mipA在鼠伤寒沙门氏菌的侵袭方面发挥着重要作用。
【关键词】：甲型副伤寒沙门氏菌 外膜蛋白 免疫原性 鼠伤寒沙门氏菌 基因敲除
【学位授予单位】：中国食品药品检定研究院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.22
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 缩略语索引7-8
• 第一章 前言8-11
• 1.1 外膜蛋白的组成、结构及功能8
• 1.2 沙门氏菌外膜蛋白在细菌致病中的作用8-9
• 1.2.1 沙门氏菌外膜蛋白诱导巨噬细胞凋亡8-9
• 1.2.2 沙门氏菌外膜蛋白作为毒力因子9
• 1.3 沙门氏菌外膜蛋白在细菌耐药性中的作用9
• 1.4 沙门氏外膜蛋白的免疫学特性9-10
• 1.5 展望10
• 1.6 本研究的目的意义10-11
• 第二章 实验材料与仪器11-17
• 2.1 材料与试剂11-13
• 2.1.1 菌株与质粒11
• 2.1.2 主要试剂11-13
• 2.2 培养基及主要溶液的配制13-16
• 2.3 主要仪器16
• 2.4 实验动物16-17
• 第三章 实验方法17-36
• 3.1 实验步骤17-19
• 3.1.1 细菌基因组 DNA 小量提取17
• 3.1.2 质粒小量提取17-18
• 3.1.3 DNA 凝胶回收18
• 3.1.4 质粒或连接产物转化感受态18-19
• 3.2 btuB、mipA、nmpC 和 pagC 基因在肠道细菌中的存在状况19-20
• 3.2.1 引物设计19
• 3.2.2 nmpC、pagC、btuB 和 mipA 目的基因的扩增19-20
• 3.3 甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白的免疫原性研究20-25
• 3.3.1 蛋白的诱导表达20
• 3.3.2 Western Blot 鉴定重组蛋白20-21
• 3.3.3 目的蛋白的纯化21
• 3.3.4 BCA 法测定蛋白浓度21-22
• 3.3.5 壳聚糖和铝佐剂对外膜蛋白免疫原性的影响22-23
• 3.3.6 his 标签对外膜蛋白免疫原性的影响23-24
• 3.3.7 多个外膜蛋白联合的免疫原性24
• 3.3.8 总 IgG 抗体的测定24-25
• 3.4 鼠伤寒沙门氏菌 mipA 基因功能的研究25-36
• 3.4.1 鼠伤寒沙门氏菌菌株鉴定25-26
• 3.4.2 mipA 突变株及互补株的构建26-33
• 3.4.3 野生株、基因缺失株和互补株毒力相关性研究33-36
• 第四章 实验结果36-64
• 4.1 btuB、mipA、nmpC 和 pagC 基因在肠道细菌中的存在状况36-44
• 4.1.1 btuB、mipA、nmpC 和 pagC 基因序列测定36
• 4.1.2 btuB 基因分布结果36-37
• 4.1.3 mipA 基因分布结果37-39
• 4.1.4 nmpC 基因分布结果39-41
• 4.1.5 pagC 基因分布结果41-42
• 4.1.6 结果与讨论42-43
• 4.1.7 小结43-44
• 4.2 甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白的免疫原性研究44-52
• 4.2.1 蛋白表达形式的确定44-45
• 4.2.2 Western Blot 鉴定结果45
• 4.2.3 NmpC、PagC、his-NmpC 和 his-PagC 蛋白的纯化45-48
• 4.2.4 IgG 抗体滴度检测48-50
• 4.2.5 结果与讨论50-51
• 4.2.6 小结51-52
• 4.3 鼠伤寒沙门氏菌 mipA 功能的研究52-64
• 4.3.1 鼠伤寒沙门氏菌菌株的鉴定52-54
• 4.3.2 mipA 突变株和互补株的构建54-56
• 4.3.3 突变株 PCR 鉴定56-57
• 4.3.4 野生株、突变株和互补株的鉴定57-59
• 4.3.5 半数致死量及竞争指数结果59-61
• 4.3.6 结果与讨论61-62
• 4.3.7 小结62-64
• 第五章 结语64-66
• 致谢66-67
• 参考文献67-73
• 综述73-83
• 参考文献78-83
• 附录 1 16SrDNA 序列比对结果83-86
• 附录 2 btuB、mipA、pagC 和 nmpC 序列比对结果86-88
• 附录 3 btuB、mipA、nmpC 和 pagC 外膜蛋白基因在肠道细菌中的存在图注88-91
• 附录 4 btuB、mipA、pagC 和 nmpC 基因所用肠道细菌菌株详细信息91-94

【参考文献】

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本文编号：322552