基于LC-MS/MS的超级细菌耐药酶NDM-1的检测、降解抗生素特性及YH-8药代动力学

发布时间：2021-06-16 02:00

　　近十年来,G-杆菌耐药问题日益严重,突出表现在耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌科细菌（大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌等）、非发酵糖细菌（鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等）,其中肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌耐药最为严重,临床治疗困难。产NDM-1超级细菌首先在印度新德里发现,主要见于大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌等肠杆菌科细菌,对临床常用的大多数抗生素包括碳青霉烯类抗生素耐药,可广泛传播,已经引起全世界的广泛关注和高度重视。产NDM-1超级细菌对临床大多数抗生素耐药,治疗困难,而且其临床表现与敏感菌没有明显差异,临床诊断困难,临床上对碳青霉烯治疗无效的阴性菌感染需要考虑这类细菌感染可能。目前产NDM-1超级细菌的实验室检查主要分三步,该方法存在周期长、操作复杂、准确性不高等缺点。因此,迫切需要建立产NDM-1超级细菌的早期、快速、准确的诊断方法。本论文旨在应用高灵敏度、高分辨率、高精确度的蛋白质谱检测技术（Nano UPLC Orbitrap）和生物信息分析系统,在现有耐药菌诊断技术和方法基础上,建立产NDM-1超级细菌感染的早期、快速、准确的... 

【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：215 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
第一部分 基于LC-MS/MS技术的超级细菌耐药酶NDM-1的检测及降解抗生素特性研究
    中文摘要
    Abstract
    缩略语表
    第1章 前言
        1 抗生素耐药现状
        2 细菌耐药酶诊断技术研究现状
        3 液质联用技术在蛋白质研究中的应用
    4 本课题研究目的和内容
    第2章 重组细菌耐药酶的表达纯化
        1 实验材料
            1.1 菌株
            1.2 培养基
            1.3 试剂和药品
            1.4 缓冲液
            1.5 仪器设备
        2 实验方法
            2.1 NDM-1蛋白的诱导表达
            2.2 细菌菌体收集及超声破碎
            2.3 纯化目的蛋白
            2.4 蛋白样品的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
            2.5 对蛋白胶进行考马斯亮蓝快速染色
            2.6 蛋白浓度测定
            2.7 其他重组细菌耐药酶的表达、纯化
        3 结果
            3.1 目的蛋白诱导表达及纯化
            3.2 蛋白浓度测定
        4 讨论
        5 小结
    第3章 重组细菌耐药酶的LC-MS/MS检测
        1 实验材料
            1.1 药品与试剂
            1.2 耗材
            1.3 主要仪器
        2 实验方法
            2.1 重组蛋白PAGE胶制备
            2.2 蛋白酶解条件的建立
            2.3 LC-MS/MS分析条件
            2.4 数据处理
        3 结果
            3.1 LC-MS/MS分析
            3.2 Mascot检索
        4 讨论
            4.1 蛋白酶解
            4.2 LC-MS/MS分析条件
            4.3 Mascot检索
        5 小结
    第4章 肺炎克雷伯杆菌中NDM-1的LC-MS/MS检测
        1 实验材料
            1.1 菌株
            1.2 培养基
            1.3 试剂和药品
            1.4 溶液制备
            1.5 仪器设备
        2 实验方法
            2.1 肺炎克雷伯杆菌ATCC BAA2146的培养
            2.2 肺炎克雷伯杆菌ATCC BAA2146裂解液的制备
            2 .3 肺炎克雷伯杆菌ATCC BAA2146裂解液蛋白电泳
            2.4 蛋白浓度测定
            2.5 蛋白酶解
            2.6 LC-MS/MS分析
            2.7 数据处理
        3 结果
            3.1 SDS-PAGE电泳
            3.2 蛋白浓度
            3.3 LC-MS/MS分析
            3.4 Mascot检索
        4 讨论
        5 小结
    第5章 基于LC-MS/MS的感染动物血清中NDM-1的检测
        1 实验材料
            1.1 菌株
            1.2 培养基
            1.3 实验动物
            1.4 试剂和药品
            1.5 仪器设备
        2 实验方法
            2.1 肺炎克雷伯杆菌ATCC BAA2146的培养
            2.2 全身感染动物模型的建立
            2.3 感染血清预处理
            2.4 血清高丰度蛋白去除
            2.5 SDS-PAGE电泳
            2.6 蛋白酶解
            2.7 LC-MS/MS分析
            2.8 实验室三步法验证
            2.9 数据处理
        3 结果
            3.1 SDS-PAGE电泳
            3.2 LC-MS/MS分析结果
            3.4 实验室三步法验证
        4 讨论
        5 小结
    第6章 NDM-1对β-内酰胺类抗生素降解特性研究
        1 实验材料
            1.1 药品与试剂
            1.2 耗材
            1.3 主要仪器
        2 实验方法
            2.1 LC-MS/MS分析条件
            2.2 确定各底物最佳测定波长
            2.3 抗生素对NDM-1的稳定性测试
            2.4 NDM-1的酶动力学
        3 结果
            3.1 各底物最佳吸收波长
            3.2 抗生素对NDM-1的稳定性试验
            3.3 NDM-1的酶动力学特征
        4 讨论
            4.1 LC-MS/MS分析条件
            4.2 抗生素对NDM-1的稳定性
            4.3 NDM-1的酶动力学特性
        5 小结
    第7章 讨论与结论
        1 讨论
        2 结论
    参考文献
第二部分 新型抗结核候选物YH-8的临床前药代动力学研究
    中文摘要
    Abstract
    缩略语表
    第1章 前言
        1 结核病现状
        2 抗结核药物研发现状
        3 液-质联用技术及其在药物研究中的应用
        4 本课题研究目的和内容
    第2章 生物样品中YH-8的LC-MS/MS分析方法的确立
        1 实验材料
            1.1 药品与试剂
            1.2 实验动物
            1.3 耗材
            1.4 主要仪器
        2 生物样品预处理
            2.1 溶液的配制
            2.2 生物样品的预处理
        3 LC-MS/MS分析条件
            3.1 色谱条件
            3.2 质谱条件
        4 分析方法确证
            4.1 特异性
            4.2 标准曲线及线性范围
            4.3 灵敏度
            4.4 精密度和准确性
            4.5 提取回收率
            4.6 基质效应
            4.7 稳定性
        5 分析方法的实施
        6 结果
            6.1 特异性
            6.2 标准曲线、线性范围和灵敏度
            6.3 精密度和准确性
            6.4 提取回收率和基质效应
            6.5 稳定性
        7 讨论
            7.1 样品的前处理
            7.2 色谱条件
            7.3 质谱条件
        8 小结
    第3章 YH-8在大鼠体内的药代动力学研究
        1 实验材料
        2 实验方法
            2.1 YH-8药液的配制
            2.2 动物饲养及给药
            2.3 血样采集
            2.4 样品处理与分析
        3 结果
            3.1 血药浓度
            3.2 药时曲线
            3.3 药代动力学参数
        4 讨论
            4.1 给药剂量
            4.2 药物动力学
        5 小结
    第4章 YH-8在大鼠体内的组织分布研究
        1 实验材料
        2 实验方法
            2.1 YH-8药液的配制
            2.2 动物饲养及给药
            2.3 大鼠给药方案和药品采集
            2.4 样品处理与分析
        3 结果
            3.1 色谱行为
            3.2 大鼠的组织样品标准曲线绘制
            3.3 组织药物浓度
        4 讨论
            4.1 检测方法适用性
            4.2 药物的组织分布
        5 小结
    第5章 YH-8的生物转化研究
        1 实验材料
            1.1 药品与试剂
            1.2 混合人肝微粒体和cDNA重组表达的人源P450微粒体
            1.3 实验动物
            1.4 耗材
            1.5 主要仪器
        2 实验方法
            2.1 肝脏体外代谢
            2.2 动物实验
            2.3 LC-MS/MS分析条件
        3 结果
            3.1 肝脏体外代谢结果
            3.2 大鼠体内实验结果
        4 讨论
            4.1 人肝微粒体体系
            4.2 代谢酶亚型确定
            4.3 代谢产物鉴定
            4.4 基本代谢途径
        5 小结
    第6章 YH-8代谢酶抑制研究
        1 实验材料
            1.1 药品与试剂
            1.2 耗材
            1.3 仪器
            1.4 溶液的配制
        2 实验方法
            2.1 CYP3A4的酶抑制研究
            2.2 CYP2C9的酶抑制研究
            2.3 CYP2C19的酶抑制研究
            2.4 CYP2D6的酶抑制研究
            2.5 CYP1A2的酶活性研究
            2.6 数据处理
        3 结果
        4 讨论
            4.1 CYP450重组酶亚型的选择
            4.2 孵育体系
            4.3 YH-8的酶抑制评价
        5 小结
    第7章 讨论与结论
        1 讨论
        2 结论
    参考文献
总结与展望
文献综述
    参考文献
个人简历、在校期间发表的学术文章
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]细菌耐药分析及耐药酶的检测探讨[J]. 陈巧荣.  中外医疗. 2012(12)
[2]儿童产超广谱β-内酰胺酶菌株感染危险因素分析[J]. 刘建华,刘新锋,帅金凤,武芳,胡皓夫.  中国当代儿科杂志. 2011(12)
[3]135株鼠伤寒沙门菌耐药酶检测及药物敏感性分析[J]. 郭宝俊,曹小燕,何昱苇.  中华医院感染学杂志. 2011(20)
[4]小儿下呼吸道感染病原菌产超广谱β-内酰胺酶的检测分析[J]. 杨善浦,董虹.  中华医院感染学杂志. 2010(23)
[5]P450酶的研究进展[J]. 崔颖,张永旺.  中国新技术新产品. 2009(16)
[6]医院感染常见耐药菌群及耐药酶的临床意义[J]. 王怡云.  甘肃医药. 2008(06)
[7]灯盏细辛注射液对小鼠肝微粒体细胞色素P450含量的影响[J]. 许黎君,居文政,陈为烤,谈恒山.  中国临床药理学与治疗学. 2008(10)
[8]液相色谱-串联质谱法对植物源性食品中4种吡啶类除草剂残留量的测定[J]. 陈波,靳保辉,谢丽琪,沈金灿.  分析测试学报. 2008(10)
[9]药物代谢转化和样品前处理技术的研究进展[J]. 孔琦,张振清.  国际药学研究杂志. 2008(02)
[10]适用于LC-MS的三聚氰胺检测新方法[J]. 冯薇,王伯初,米鹏程,雷宇,周提军,杜慧娟,王兵.  广东农业科学. 2008(04)

硕士论文
[1]高效液相色谱—质谱法在中成药分析中的应用研究[D]. 许海棠.广西大学 2008



本文编号：3232133