重组人IL-4、IL-13的克

发布时间：2017-04-24 02:06

  本文关键词：重组人IL-4、IL-13的克隆、表达和鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：白细胞介素（interleukin，IL）是非常重要的细胞因子家族，在调节细胞生长分化、免疫细胞的活化与分化、调节免疫应答、诱导炎症发生过程中起重要作用。目前发现的成员已达35个，被命名为IL-1～IL-35。IL-4和IL-13主要由活化的CD4+Th2细胞产生，活化的肥大细胞等也可产生。IL-4和IL-13共享信号传导系统，二者都可与靶细胞上由IL4Rα链和IL13Rα1链组成的受体复合物结合，从而将信号传导到胞浆，故二者部分功能重叠。IL-4和IL-13可通过激活嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞促进气道炎症，增强纤维母细胞的增殖与活化引起气道重塑；激活B细胞产生IgE；刺激气道上皮细胞、杯状细胞产生黏液；激活气道平滑肌细胞引起气道高反应性，在过敏性炎症疾病中起着重要的作用。基于IL-4/IL-13信号途径在过敏性炎症疾病中发挥重要的作用，可通过阻断Il-4/IL-13信号传导干预治疗过敏性炎症疾病，但以往研究表明，抗IL-4和抗IL-13的单克隆抗体用于治疗过敏性炎症疾病，未取得满意效果。因此，制备中和性抗IL-4和IL-13双特异性抗体，以封阻它们的生物学活性，对于过敏性炎症疾病的治疗具有很大的潜力。本研究克隆、表达及鉴定了人IL-4和IL-13重组蛋白，为后期双特异性抗体的制备奠定基础。方法：1.从健康志愿者外周血中分离PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cell，外周血单个核细胞），提取总RNA，从NCBI（National Center ofBiotechnology Information，美国国家生物技术信息中心）下载人IL-4和IL-13mRNA序列，设计引物，采用RT-PCR扩增IL-4和IL-13cDNA。2.将PCR产物与pET101/D-TOPO载体连接，转化E. coli TOPO10，菌落PCR验证基因插入是否正确，提取重组质粒送上海生物技术有限公司进行测序验证。3.将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21，小量表达，SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析筛选高表达量克隆子。4.筛选到的高表达量克隆子用1mmol/L IPTG （isopro pyl-β-d-thiogalactoside，异丙基-β-d-硫代半乳糖苷）诱导表达，按Invitrogen公司的Ni-NTA纯化试剂盒的变性条件纯化蛋白。5. Western blot鉴定表达的融合蛋白。结果：1. PCR最终扩增得到IL-4开放阅读框基因，其大小为460bp左右；扩增得到IL-13开放阅读框基因，，其大小为430bp左右，测序验证序列正确。2. IL-4/pET101和IL-13/pET101重组质粒测序验证序列正确。3.诱导表达后的IL-4融合蛋白条带大小为28kDa左右，与目的蛋白大小一致。相同条件下4个克隆子中IL4-1表达量最高，其次是IL4-2和IL4-4，IL4-3基本无表达；诱导表达后的IL-13融合蛋白条带大小为26kDa左右，与目的蛋白大小一致。4.将大量表达的IL4-1和IL-13应用Ni-NTA亲和纯化柱在变性条件下进行了纯化。结果表明：纯化的IL-4蛋白在28kDa处出现了单一条带，与目的蛋白大小一致；纯化的IL-13在26kDa处出现了单一条带，与目的蛋白大小一致。5.将表达的IL4-1蛋白和IL-13蛋白进行Western blot验证，结果显示，表达的蛋白即为目的蛋白IL-4和IL-13。结论：1.成功扩增到IL-4的开放阅读框基因，其大小为460bp；成功扩增到IL-13的开放阅读框基因，其大小为430bp。2.成功构建了人IL-4/pET101和IL-13/pET101重组表达载体。3.成功表达并纯化了人IL-4和IL-13融合蛋白。
【关键词】：人IL-4 人IL-13 表达 鉴定
【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 目录3-4
• 摘要4-7
• Abstract7-10
• 前言10-14
• 材料与方法14-24
• 结果24-32
• 讨论32-37
• 结论37-38
• 参考文献38-42
• 英汉缩略词对照表42-43
• 致谢43-44
• 综述44-55
• 参考文献51-55

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