UGT1A1基因重组质粒的构建及鉴定
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【摘要】:目的:分别构建尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT1A1)基因野生型、G71R纯合突变型重组质粒,利用脂质体介导转染于COS-7细胞,并检测UGT1A1的表达,为后续研究UGT1A1基因突变表达提供工具、奠定实验基础。 方法: (1)利用基因重组技术分别克隆人UGT1A1野生型、G71R(211G→A)纯合突变型基因作为目的基因,将目的基因与pIRES2-EGFP载体质粒分别双酶切后连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性转化子进行PCR和基因测序分析,从而判断重组质粒是否构建成功。 (2)设立UGT1A1野生型转染组、G71R纯合突变型转染组、空载体转染组、未转染组四组,,利用脂质体介导转染于COS-7细胞,转染后在荧光显微镜下观察转染效率。 (3)利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)、免疫印迹(Western blot)分别检测UGT1A1在COS-7细胞中的mRNA水平和蛋白水平的表达。 结果: (1)PCR扩增UGT1A1野生型、G71R纯合突变型目的基因,琼脂糖凝胶电泳获得约1622bp大小的目的基因片段。 (2)重组质粒进行基因测序鉴定,显示UGT1A1野生型重组质粒结果与UGT1A1mRNA(NM_000463)的碱基序列完全相同,同源性为100%,G71R纯合突变型重组质粒与UGT1A1mRNA(NM_000463)的碱基序列仅相差1个碱基(211G→A),与预期点突变结果完全一致,同源性为99%。 (3)重组质粒及空载体质粒转染48小时后的COS-7细胞在荧光显微镜下可见显著绿色荧光标记,转染效率约为40%;未转染组的COS-7细胞未见绿色荧光标记。 (4)野生型转染组和突变型转染组COS-7细胞UGT1A1的mRNA和蛋白相对表达量显著高于空载体转染组和未转染组(P<0.05);空载体转染组与未转染组间无明显差异(P>0.05)。 结论: (1)UGT1A1基因野生型、G71R纯合突变型重组质粒构建成功。 (2)转染了UGT1A1基因野生型、G71R纯合突变型重组质粒的COS-7细胞能够表达UGT1A1。
【关键词】:尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1 G71R纯合突变 重组质粒 COS-7细胞
【学位授予单位】:广西医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R3416
【目录】:
- 中英文缩略语4-5
- 摘要5-7
- ABSTRACT7-10
- 前言10-11
- 材料和方法11-30
- 1. 实验材料11-15
- 2. 实验方法15-30
- 结果30-42
- 讨论42-48
- 结论48-49
- 参考文献49-56
- 综述56-74
- 参考文献64-74
- 致谢74-75
- 攻读学位期间发表的学术论文75
【参考文献】
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本文编号:323562
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