应用特异性免疫磁珠快速检测单增李斯特菌

发布时间：2017-04-24 06:12

  本文关键词：应用特异性免疫磁珠快速检测单增李斯特菌，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：研制单增李斯特菌特异性免疫磁珠，结合免疫磁珠富集技术与选择性平板培养法，初步建立免疫磁珠-选择性平板快速检测方案，对单增李斯特菌进行分离及鉴定。同时，利用免疫磁珠富集技术进行样品前处理，联合环介导等温扩增技术，建立一种快速检测单增李斯特菌的新方法。 方法：利用分泌单增李斯特菌单克隆抗体的杂交瘤细胞（1B10A7），制备并纯化腹水型单抗；选择三种表面官能团不同的磁珠制备特异性免疫磁珠；通过比较免疫磁珠捕菌率高低挑选合适磁珠，建立免疫磁珠-选择性培养基检测方法；通过特异性分析、灵敏度分析及牛奶样品检测评价该方法的检测效果。随后，以单增李斯特菌毒力基因hly和prfA为模板设计环介导等温扩增引物，经阳性筛选、交叉菌筛选及荧光定量PCR挑选最佳引物，PCR扩增产物经分子克隆后测序鉴定；建立免疫磁珠-环介导等温扩增检测方法，通过灵敏度分析和牛奶样品检测对该方法进行评价。 结果：制备了效价为6×10~4的腹水型单抗，单抗偶联磁珠后，选择捕菌率最佳的Dynal甲苯磺酰基活化磁珠进行后续试验；特异性免疫磁珠联合选择性平板法可检出浓度为103CFU/mL及以上的单增李斯特菌，仅与英诺克李斯特菌存在交叉反应；牛奶样品单次仅需6h增菌能被检出，较常规增菌时间缩短42h；检测限为0.7CFU/mL。经筛选获得一组prfA基因高特异性且扩增效率最高的引物对，扩增产物经测序鉴定与靶序列吻合；免疫磁珠-环介导等温扩增检测方法检测灵敏度为10~1CFU/mL，对牛奶样品的检测限为1CFU/mL。 结论：联合使用免疫磁珠富集技术与选择性培养基，能在30h内完成对牛奶样品的检测，较国标法减少42h以上，且具有同等的灵敏度。免疫磁珠-环介导等温扩增检测方法具有高特异性、高灵敏度及快速检测的优势，在不进行预增菌的情况下对含菌量较低的阳性样品亦可检出。本研究结合免疫磁珠富集技术，初步建立了单增李斯特菌快速检测方法，通过进一步的条件摸索及优化，日后有望应用到食品安全监测工作中。
【关键词】：免疫磁珠 富集 单克隆抗体 单增李斯特菌 环介导等温扩增技术 检测限
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R446.6;R378.994
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 前言8-21
• 1 免疫磁珠分离技术8-11
• 1.1 免疫磁珠的结构8-9
• 1.2 免疫磁珠富集作用原理9
• 1.3 免疫磁珠富集优势9-11
• 1.4 免疫磁珠富集技术在食源性致病菌检测中的应用11
• 2 单增李斯特菌的概述11-14
• 2.1 单增李斯特菌的生物学特征及血清型分类11-12
• 2.2 单增李斯特菌的致病机理及毒力因子12-13
• 2.3 单增李斯特菌的危害13-14
• 3 单增李斯特菌检测方法的研究进展14-16
• 3.1 传统分离及生化鉴定14-15
• 3.2 免疫学检测15
• 3.3 分子生物学诊断15-16
• 4 环介导等温扩增（LAMP）技术16-19
• 4.1 LAMP 技术扩增原理及步骤16-17
• 4.2 LAMP 技术特点17-19
• 5 本研究的目的和意义19-20
• 6 技术路线图20-21
• 第二章 单增李斯特菌 IMB-显色培养基检测方法研究21-37
• 1 材料21-25
• 1.1 主要试剂和仪器设备21-22
• 1.2 菌株22
• 1.3 实验动物22
• 1.4 主要溶液的配制方法22-25
• 2 试验方法25-29
• 2.1 菌株的培养及灭活处理25
• 2.2 单增李斯特菌腹水型单抗的制备及纯化25-27
• 2.3 单增李斯特菌免疫磁珠的制备27-28
• 2.4 IMB-选择性培养基检测方法的建立28-29
• 2.5 IMB-选择性培养基法检测人工污染牛奶样品29
• 3 结果与分析29-34
• 3.1 单增李斯特菌单抗的纯化及鉴定29-31
• 3.2 单增李斯特菌免疫磁珠的制备31-32
• 3.3 IMB-选择性培养基检测方法的建立32-33
• 3.4 IMB-选择性培养基法检测人工污染牛奶样品33-34
• 4 讨论34-37
• 第三章 单增李斯特菌 IMB-LAMP 检测方法研究37-51
• 1 材料37-39
• 1.1 主要试剂和仪器设备37-38
• 1.2 菌株38
• 1.3 主要溶液的配制方法38-39
• 2 试验方法39-44
• 2.1 菌株的培养39
• 2.2 细菌 DNA 的提取39-40
• 2.3 单增李斯特菌特异性 LAMP 引物的设计40-43
• 2.4 IMB-LAMP 方法的建立43
• 2.5 IMB-LAMP 方法检测牛奶样品43-44
• 3 结果与分析44-49
• 3.1 单增李斯特菌特异性 LAMP 引物的筛选及鉴定44-47
• 3.2 免疫磁珠捕菌率的鉴定47
• 3.3 IMB-LAMP 灵敏度的测定47-48
• 3.4 IMB-LAMP 方法检测人工污染牛奶样品48-49
• 4 讨论49-51
• 第四章 结论与展望51-52
• 参考文献52-58
• 在校期间发表论文和学术交流情况58-60
• 致谢60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 徐金亭;李志清;向军俭;唐勇;杨红宇;;单增李斯特菌免疫磁珠的制备研究[J];食品工业科技;2012年05期

2 张加林;杨林娴;;单增李斯特菌的食源性污染状况及检测方法[J];医学理论与实践;2012年08期

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 张亚爽;LAMP和PCR检测单核细胞增生性李斯特氏菌的研究[D];河北农业大学;2008年

2 李志清;单增李斯特菌特异性的膜表面蛋白的抗体的制备[D];暨南大学;2012年

  本文关键词：应用特异性免疫磁珠快速检测单增李斯特菌，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：323709