抑制新型布尼亚病毒感染化合物的筛选及其作用机制的研究

发布时间：2017-04-24 11:03

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【摘要】：2009年我国发现了一种新型布尼亚病毒，该病毒能引起发热和血小板减少等症状因此被命名为发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）。SFTSV属于布尼亚病毒科，白蛉病毒属的分段负义RNA病毒，该病毒导致的人类严重发热伴血小板减少综合征。目前对其侵染细胞的具体机制尚不明确，临床上亦无有效的治疗方法。了解病毒的感染过程是有效预防和治疗疾病的基础，本文以筛选抑制SFTSV感染的化合物作为切入点，通过研究受体酪氨酸激酶（RTKs）与SFTSV感染之间的关系，探究SFTSV的感染机制。 本研究中，我们首先以免疫荧光染色和实时定量PCR（qRT-PCR）为检测手段描述了SFTSV在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中的复制及释放情况，并筛选出2种对感染有明显抑制作用的化合物，由于这两种化合物是受体酪氨酸激酶或其下游PI3K/AKT-mTOR信号通路中的抑制剂，因此我们利用磷酸化RTKs array分析了SFTSV感染后细胞RTKs磷酸化水平的变化情况，并设计了小干扰RNA（siRNA）定向沉默某些RTKs的基因，研究SFTSV感染与RTKs之间的关系，以期对研究SFTSV感染宿主细胞的机制有所启示。通过研究我们发现，感染SFTSV的细胞在形态学上并无太大变化，细胞中病毒含量随感染时间的延长呈典型的“S型”曲线增长，而在培养上清中病毒以“波浪式”增长的方式持续上升至很高的滴度，这与临床报告中患者伴有高病毒血症的事实相符。研究还发现，化合物BEZ235和Sunitinib能抑制SFTSV感染，且与病毒同时加入或感染2小时后再加入化合物仍能有效的抑制SFTSV感染，其中BEZ235为磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）p110亚基及雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的抑制剂，Sunitinib为血小板衍生生长因子受体β（PDGFRβ）及血管内皮生长因子受体（VRGFR）抑制剂，这一现象说明SFTSV可能在进入细胞之后的过程中利用了RTKs-PI3K/AKT-mTOR信号通路完成自身生命活动。之后我们对SFTSV感染后细胞RTKs磷酸化水平变化进行RTK磷酸化array分析，并在此基础上设计了针对不同RTKs的siRNA，发现在HUVEC细胞中沉默神经营养因子受体1（TrkA）基因表达，SFTSV的感染受到明显抑制，，在Hela细胞中沉默PDGFRβ基因及在cos7细胞中沉默VEGFR1基因，都能在一定程度上降低SFTSV的感染水平，而在HUVEC细胞中沉默成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）基因表达反而促进SFTSV的感染。这些研究结果提示我们，SFTSV的感染可能激活了TrkA、PDGFR、VEGFR等RTKs，并通过宿主细胞的RTKs-PI3K/Akt-mTOR信号传导通路完成基因组复制、转录、病毒蛋白质合成、装配及子代病毒的释放等感染后期过程。 关于本文中筛选出的两种化合物对SFTSV感染的抑制作用，在此之前并未见过相关报道，此外也未见到关于该病毒感染与RTKs之间的相关性的报道，因此本研究具有一定的创新性。 本研究的结果为从分子水平上研究SFTSV感染的具体过程，了解其发病机制，制定有效的预防和治疗方法提供了新的实验依据。
【关键词】：新型布尼亚病毒 抗病毒化合物 PI3K/AKT RNA干扰
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 目录8-13
• 主要英文缩写注释表13-15
• 第一章 绪论15-28
• 1.1 引言15
• 1.2 发热伴血小板减少综合症病毒概况15-24
• 1.2.1 病毒结构15-18
• 1.2.2 病毒生活史18-22
• 1.2.3 流行病学22-23
• 1.2.4 临床表现、检查及确诊方法23
• 1.2.5 临床治疗及预防控制措施23-24
• 1.3 目前国内外研究进展24-25
• 1.4 本文涉及的实验技术简介25-27
• 1.4.1 免疫荧光染色25-26
• 1.4.2 实时定量 PCR 技术26
• 1.4.3 RNA 干扰技术26-27
• 1.5 研究目的及意义27-28
• 第二章 SFTSV 的定量、感染及检测28-42
• 2.1 前言28
• 2.2 实验材料与仪器28-30
• 2.2.1 病毒及细胞28
• 2.2.2 主要试剂28-29
• 2.2.3 主要溶液配制29
• 2.2.4 主要仪器29-30
• 2.2.5 引物及质粒30
• 2.3 实验方法30-37
• 2.3.1 细胞培养30-31
• 2.3.2 病毒滴度测定31-32
• 2.3.3 TRIzol 法提取总 RNA32-33
• 2.3.4 RNA 反转录33
• 2.3.5 实时定量 PCR33-35
• 2.3.6 免疫荧光染色35
• 2.3.7 MOI 值计算35-36
• 2.3.8 以 HUVEC 测定 SFTSV 的感染及释放36-37
• 2.4 实验结果37-40
• 2.4.1 SFTSV 定量37-38
• 2.4.2 SFTSV 感染及释放时间曲线38-40
• 2.5 讨论40-42
• 第三章 抑制 SFTSV 感染化合物的筛选42-56
• 3.1 前言42
• 3.2 实验材料与仪器42-46
• 3.2.1 病毒及细胞42
• 3.2.2 相关化合物介绍42-45
• 3.2.3 试剂及仪器45
• 3.2.4 主要溶液配制45-46
• 3.3 实验方法46-48
• 3.3.1 细胞培养46
• 3.3.2 化合物抑制 SFTSV 感染实验46-48
• 3.4 实验结果48-54
• 3.4.1 化合物对 Hela 细胞感染的影响48-49
• 3.4.2 化合物对 RD 细胞及 HUVEC 感染的影响49-54
• 3.4.3 BEZ235 和 Sunitinib 对感染后细胞的保护作用54
• 3.5 讨论54-56
• 第四章 感染对受体酪氨酸磷酸酶磷酸化水平的影响56-63
• 4.1 前言56-58
• 4.2 实验材料与仪器58-59
• 4.2.1 病毒及细胞58
• 4.2.2 试剂与仪器58
• 4.2.3 主要溶液配制58-59
• 4.3 实验方法59-61
• 4.3.1 细胞培养59
• 4.3.2 RTKs 磷酸化水平阵列分析59-61
• 4.4 实验结果61-62
• 4.5 讨论62-63
• 第五章 利用小干扰 RNA 研究 SFTSV 的感染机制63-75
• 5.1 前言63
• 5.2 实验材料与仪器63-64
• 5.2.1 病毒及细胞63
• 5.2.2 试剂与仪器63-64
• 5.2.3 主要溶液配制64
• 5.3 实验方法64-69
• 5.3.1 siRNA 及 qRT-PCR 检测引物设计64-66
• 5.3.2 检测不同细胞系中目的基因的表达情况66-67
• 5.3.3 siRNA 转染67
• 5.3.4 siRNA 干扰效率检测67-68
• 5.3.5 RTKs 表达水平降低对 SFTSV 感染的影响68-69
• 5.4 实验结果69-73
• 5.4.1 不同细胞系中 RTKs 的表达情况69-70
• 5.4.2 siRNA 沉默目的基因效率70-71
• 5.4.3 RTKs 基因沉默对 SFTSV 感染的影响71-73
• 5.5 讨论73-75
• 全文总结75-77
• 参考文献77-80
• 致谢80

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