裂头蚴河南不同地理株的虫种鉴定、遗传变异及抗原多肽基因的表达及鉴定

发布时间：2017-04-25 07:13

  本文关键词：裂头蚴河南不同地理株的虫种鉴定、遗传变异及抗原多肽基因的表达及鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：裂头蚴病(sparganosis)主要是由曼氏迭宫绦虫(Spirometra mansoni)幼虫-裂头蚴(sparganum)感染而引起的一种严重的人兽共患寄生虫病,该病呈世界性分布。裂头蚴感染人体后,可在各种组织器官内移行引起炎症反应,导致皮下包块、失明、肢体麻痹、癫痫、甚至死亡。传统的迭宫属绦虫的鉴别主要是通过形态学鉴定,而迭宫属绦虫的幼虫阶段缺乏形态学特征难以鉴别,因此,应用分子生物学方法对迭宫属绦虫幼虫进行虫种鉴定及遗传变异分析,对裂头蚴病的防治具有重要意义。此外,裂头蚴含有重复序列的抗原多肽(antigenic polypeptide, SAP, GenBank No. AB019222.1)可能是裂头蚴的保护性抗原,对裂头蚴的免疫逃避及其在宿主体内的长期寄生可能起着重要作用。 为了鉴定裂头蚴河南不同地理株的虫种、研究其遗传变异与系统发育地位,本文从河南省6个地区(开封、郑州、扶沟、新乡、漯河、周口)自然感染的青蛙体内分离裂头蚴,经口感染家猫后收集虫卵与成虫进行形态学鉴定,选取曼氏迭宫绦虫3个线粒体基因(cox1、cox3和nad4)作为分子标记,对河南6个地区的裂头蚴进行了序列分析及遗传变异分析。此外,本文还应用基因工程技术对裂头蚴抗原多肽基因进行了克隆与表达,将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠获得重组蛋白免疫血清,应用Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)发现裂头蚴抗原多肽在曼氏迭宫绦虫不同发育期的表达及其在虫体组织的定位,并将其用于裂头蚴感染小鼠血清的特异性抗体的检测,对裂头蚴病的检测提供新的候选抗原。 材料与方法 1.裂头蚴的采集与实验动物感染：从河南省漯河、开封、郑州、新乡、通许、扶沟六地区自然感染青蛙体内分离裂头蚴。将六地区分离出的裂头蚴经口感染6只3月龄的无病原体家猫(10条／只),在感染后8-25天当中,每天使用自然沉淀法收集猫粪便中的虫卵在显微镜下进行鉴定,感染后4周将猫剖杀,从猫小肠内收集成虫并进行形态学鉴定。 2.幼虫和成虫目的基因的扩增及序列分析：对曼氏迭宫绦虫cox1、cox3和nad4三个线粒体基因进行PCR扩增,将纯化后的PCR产物送北京金唯智生物公司进行双向测序。首先使用Clustal X v2.0中的默认参数设置对3个基因序列进行比对然后在Se-Al v2.0a11中对比对序列进行校正。使用MEGA v5.0软件进行遗传距离分析。 3.系统发育分析：最后分别利用PAUP*4b10、PhyMLv3.0和MrBayes v3.1软件对cox1+cox3+pnad4三基因联合序列进行最大简约法(MP)、最大似然法(ML)和贝叶斯法(BI)分析,并绘制曼氏迭宫绦虫河南省6个地区分离株的系统发育树。 4.裂头蚴抗原多肽基因的克隆与表达：合成裂头蚴抗原多肽基因,并在序列两端添加酶切位点5’BamHI和3'HindⅢ保证在裂头蚴抗原多肽基因序列中仅有BamHI和HindⅢ2个酶切位点。将多肽基因克隆至载体pUC57-Kan。将目的基因双酶切后亚克隆至表达载体pMAL-c2X,构建重组质粒pMAL-c2X-SAP,转化入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,对重组质粒pMAL-c2X-SAP进行酶切鉴定,结果正确后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,收集菌体沉淀经超声破碎后进行SDS-PAGE,观察是否有抗原多肽蛋白的表达,并对表达产物进行可溶性分析。 5.裂头蚴抗原多肽重组蛋白的鉴定：应用Amylose树脂预装柱对表达的裂头蚴抗原多肽重组蛋白进行亲和层析纯化,将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,获得重组蛋白免疫血清,通过Western blotting应用重组蛋白免疫血清对重组蛋白、裂头蚴可溶性抗原及ES抗原进行识别。 将从自然感染蛙体与实验感染鼠体内分离的裂头蚴以及猫体内收集的成虫进行石腊切片,应用IFA检测裂头蚴抗原多肽在曼氏迭宫绦虫不同发育期虫体的表达及其在虫体组织的定位。应用重组蛋白与裂头蚴ES蛋白分别用于检测裂头蚴感染小鼠及其他寄生虫感染小鼠血清,观察SAP-ELISA诊断裂头蚴病的敏感性与特异性。 结果 1.虫卵与成虫的形态学鉴定：裂头蚴经口感染猫后11天,在猫粪便中发现虫卵；感染后4周从每只猫的小肠内检出10条26～45厘米长的成虫。虫卵卵壳较薄、浅灰褐色、呈椭圆形,52～76微米长、31～44微米宽,且两端稍尖、一端有卵盖,内有一个卵细胞和若干个卵黄细胞。基于如下形态特征将收集的成虫鉴定为曼氏迭宫绦虫：头节背、腹面各有一条纵行的吸槽,成节和孕节结构基本相似,肉眼可见每个节片中部凸起的子宫。并且在节片中部依次有雄性生殖孔、雌性生殖孔和子宫孔三个开口。 2.裂头蚴河南不同地理株的遗传变异分析：郑州、开封、通许、扶沟、新乡、漯河6地区收集的裂头蚴及其成虫的cox1,cox3和nad4基因片段,均被成功扩增,其序列长度分别为417、390和578bp,且成虫与幼虫序列大小完全一致。cox1,cox3和nad4基因片段均富含AT碱基(AT含量分别为63.5%,68.3%和67%),其序列变化范围分别为0-4.4%、0-0.8%和0-0.5%。 3.裂头蚴河南不同地理株的系统发育分析：cox,cox3和nad4序列的最适进化模型分别为TN93+I、HKY+G和HKY+I。对coxl+cox3+pnad4联合序列分别采用最大简约法、最大似然法和贝叶斯法的系统发育分析结果显示,河南6个地区的裂头蚴分离株与其他迭宫属(Spirometra)绦虫一起形成一个具有高支持值的单系分支(其自展值和后验概率值分别为100、99和1.0),并与裂头属(Diphyllobothrium)绦虫分支互为姊妹类群。 4.裂头蚴抗原多肽基因的克隆与表达：对重组质粒pMAL-c2X-SAP进行酶切鉴定,电泳后出现2条带,1条带为线性的pMAL-c2X(大小为6646bp)；另1条为783bp,与裂头蚴抗原多肽的理论值大小相同,表明重组质粒pMAL-c2X-SAP构建成功。对重组质粒pMAL-c2X-SAP进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析发现在68.7kDa处出现一条明显的蛋白带(载体融合蛋白40kDa+目的蛋白28.7kDa),表明重组蛋白表达成功,可溶性分析发现重组蛋白以可溶形式表达。 5.裂头蚴抗原多肽重组蛋白的鉴定：Western blotting结果显示,裂头蚴抗原多肽重组蛋白可被裂头蚴感染小鼠血清所识别；重组蛋白免疫血清可识别裂头蚴可溶性抗原和ES抗原,在28.7kDa处有1条蛋白带,表明裂头蚴抗原多肽在裂头蚴可溶性抗原和ES抗原均存在。IFA结果显示,重组蛋白免疫血清与蛙体与鼠体内的裂头蚴均呈现阳性反应,虫体皮层及内部组织均呈黄绿色荧光,但与成虫则为阴性反应,虫体呈橘红色,表明裂头蚴抗原多肽在裂头蚴期表达,在成虫期则不表达。SAP-ELISA和ES-ELISA检测裂头蚴感染小鼠血清抗体阳性率分别为83.8%(25/30)和100%(30/30),SAP-ELISA的阳性率低于ES-ELISA(P0.05).检测弓形虫、血吸虫、旋毛虫感染小鼠血清和正常小鼠血清均为阴性。 结论 1.经形态学及分子生物学鉴定,河南6个地区的裂头蚴分离株均属于曼氏迭宫绦虫,cox1,cox3和nad4基因均能很好地揭示裂头蚴各地理株线粒体之间的遗传变异,且coxl的变异程度最高,cox3次之而nad4的变异程度最低。 2.成功构建了裂头蚴抗原多肽的表达质粒pMAL-c2X-SAP,重组蛋白以可溶形式表达。Western blotting与IFA结果表明,裂头蚴抗原多肽在裂头蚴期表达,在裂头蚴可溶性抗原和ES抗原均存在,定位于虫体皮层及内部组织；在成虫期则不表达。 3. SAP-ELISA检测裂头蚴感染小鼠血清抗体具有良好的敏感性与特异性,提示此重组蛋白可作为检测裂头蚴病的候选抗原。
【关键词】：裂头蚴 曼氏迭宫绦虫 遗传变异 线粒体基因 抗原多肽 表达
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R383
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-15
• 英文缩略词表15-16
• 1 前言16-18
• 1.1 裂头蚴及裂头蚴病16
• 1.2 裂头蚴病的流行情况16-17
• 1.3 曼氏迭宫绦虫的系统发育研究17
• 1.4 目的与意义17-18
• 2 材料与方法18-34
• 2.1 试剂18
• 2.2 仪器18-19
• 2.3 溶液的配置19-21
• 2.3.1 DNA提取所需试剂19
• 2.3.2 LB培养基的配置19
• 2.3.3 质粒提取所需试剂19
• 2.3.4 ELISA所需试剂19-20
• 2.3.5 凝胶配制所需试剂20-21
• 2.3.6 Western blot所需试剂21
• 2.4 实验动物21-22
• 2.5 曼氏裂头蚴的采集与分离22
• 2.6 曼氏迭宫绦虫成虫的获取22-32
• 2.6.1 实验动物感染22
• 2.6.2 成虫的收集22
• 2.6.3 节片的固定及保存22
• 2.6.4 头节的固定及保存22-23
• 2.6.5 孕节标本的制作23
• 2.6.6 基因组DNA的提取23
• 2.6.7 PCR扩增23-24
• 2.6.8 序列分析24
• 2.6.9 系统发育分析24-25
• 2.6.10 裂头蚴抗原多肽基因的合成25
• 2.6.11 质粒的提取25
• 2.6.12 质粒及目的基因的双酶切及胶回收25-26
• 2.6.13 目的基因与质粒的连接反应26-27
• 2.6.14 BL21感受态细菌制备27
• 2.6.15 转化及验证27
• 2.6.16 诱导表达27-28
• 2.6.17 SDS-PAGE电泳28
• 2.6.18 重组蛋白的可溶性鉴定28-29
• 2.6.19 重组蛋白的纯化29-30
• 2.6.20 纯化后蛋白的浓度测定30
• 2.6.21 Western-blot鉴定30
• 2.6.22 动物实验30-32
• 2.7 裂头蚴抗原多肽的定位32-34
• 2.7.1 组织标本石蜡切片制作32-33
• 2.7.2 间接免疫荧光33
• 2.7.3 ELISA法检测裂头蚴及其他寄生虫感染小鼠血清33-34
• 3 结果34-50
• 3.1 曼氏裂头蚴的采集34
• 3.2 曼氏迭宫绦虫成虫34-35
• 3.3 目的基因的扩增35-37
• 3.4 序列分析37
• 3.5 系统发育分析37-38
• 3.6 裂头蚴抗原多肽基因的生物信息学分析38-41
• 3.7 抗原多肽基因的合成41-42
• 3.8 质粒的双酶切和目的基因的胶回收42-43
• 3.9 目的基因和质粒的连接及鉴定43-44
• 3.10 重组蛋白的诱导表达44-45
• 3.11 重组蛋白的可溶性分析45-46
• 3.12 重组蛋白的纯化及浓度测定46
• 3.13 标准蛋白浓度曲线及裂头蚴重组蛋白的浓度46-47
• 3.14 重组蛋白的Western-blot分析47-48
• 3.15 ELISA检测免疫血清抗体效价48
• 3.16 裂头蚴抗原多肽在虫体组织定位48-49
• 3.17 ELISA检测裂头蚴感染小鼠血清49-50
• 4 讨论50-52
• 4.1 曼氏裂头蚴的遗传变异及系统发育分析50-51
• 4.2 裂头蚴抗原多肽的克隆表达分析51-52
• 5 结论52-53
• 参考文献53-57
• 综述 曼氏裂头蚴病的流行及研究现状57-68
• 参考文献64-68
• 硕士在读期间发表的论文目录68-69
• 致谢69

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：325896