柯萨奇病毒B3 2A蛋白酶对NF-κB和IRF功能影响的研究

发布时间：2017-04-25 23:09

  本文关键词：柯萨奇病毒B3 2A蛋白酶对NF-κB和IRF功能影响的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：柯萨奇病毒(Coxsachievirus),是一类肠道病毒,分为A和B两类,此类病毒感染引起的疾病临床表现复杂多样,有无菌性脑膜炎、脑炎、心肌炎、心包炎、流行性胸肌痛、疱疹性咽峡炎等。其中B组3型柯萨奇病毒(Coxsachievirus B3,CVB3)是引起小儿病毒性心肌炎的重要病原体,CVB3持续感染可以导致慢性心肌炎和扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy, DCM)。目前柯萨奇病毒无特效抗病毒药物,研究其致病机制为抗病毒治疗提供思路。 CVB3病毒结构为二十面体结构,基因组为单正链RNA,有一个开放阅读框(open reading frame, ORF),编码4个结构蛋白和7个非结构蛋白,包括两个蛋白酶2A和3C。与其他肠道病毒相似,CVB3蛋白酶2A和3C被认为是病毒复制所必需的。已有研究证实CVB3编码的蛋白酶是DCM发生的重要致病因素,其中心脏表达蛋白酶2A的转基因小鼠可发展为重度心脏功能障碍和DCM,提示2A蛋白酶可能在CVB3病毒感染过程中参与诱导宿主细胞损伤,但其确切机制尚不明确。 CVB32A蛋白酶是一种半胱氨酸蛋白酶,具有多种生物学活性。2A蛋白酶不仅参与切割病毒多聚蛋白,而且促进病毒多聚核糖体的形成及稳定；还能通过切割翻译起始因子eIF4G I抑制细胞帽样结构依赖蛋白翻译；CVB32A还可以切割细胞骨架蛋白肌营养不良蛋白,提示与DCM有关；除此以外,2A蛋白酶能干扰宿主细胞防御系统,在病毒复制过程中发挥重要的作用。 病毒感染后,宿主免疫反应的第一道防线是先天性免疫系统,在病毒感染细胞数分钟内就可以产生逐渐增强的抗病毒反应。RNA病毒感染后,病毒RNA复制时双链RNA中间体及单链RNA基因组能够被模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)识别,PRR是位于宿主细胞膜或胞质中的一类受体蛋白,能识别特殊病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP),进而激活自分泌和旁分泌天然免疫信号,触发先天性免疫系统,细胞产生抗病毒因子干扰素(Interferon, IFN)。当细胞被病毒感染或者受各种因素刺激时,核因子-KB(Nuclear factor-KB, NF-κB)和干扰素(IFN)信号通路被激活,启动先天性免疫反应,促进细胞因子的释放,引起机体抗病毒免疫反应。 为探讨CVB3的蛋白酶2A对NF-κB和干扰素调节因子(Interferon regulatory factor, IRF)功能的影响,首先构建CVB3病毒的2A蛋白酶表达载体pcDNA3.1-CVB3-2A,将此表达载体与核转录因子(NF-κB)基因启动了荧光素酶报告基因载体NF-KB-Luc-pGL3载体共转染细胞,经TNF α刺激,检测荧光素酶活性；转染表达载体pcDNA3.1-CVB3-2A后,经TNF α刺激,通过免疫荧光和Western Blot检测CVB32A蛋白酶对真核生物转录因了NF-κB核定位和二聚体形成的影响。结果显示,CVB32A可以减少转录因子NF-κB p65表达、二聚体形成,并干扰转录因子的核转移。本研究证实CVB3的蛋白酶2A可通过干扰转录因子的二聚体形成和核转录而干扰细胞因子的分泌。将此表达载体与干扰素(IFN)基因启动子荧光素酶报告基因载体IFN-Luc-pGL3载体共转染细胞,经poly(I:C)刺激,检测荧光素酶活性；转染表达载体pcDNA3.1-CVB3-2A后,经poly(I:C)刺激,通过Western Blot检测CVB32A蛋白酶对IRF3/7细胞核浆分布的影响。本研究证实CVB3的蛋白酶2A可通过干扰IRF的表达和核浆分布而影响IFN信号通路。 同时,为了解CVB32A蛋白酶功能的结构学基础,通过分析,CVB32A蛋白酶内部具有3个核定位信号分别为aal3-18RVVNRH、aa65-70KNKHYP和aa88-93PRRYQSH,2A C端有一段酸性结构域aa133-147DIRDLLWLEDDAMEQ.针对这些可能的功能区域,构建缺失突变体的真核表达载体,分别命名为pcDNA3.1-CVB3-2A-1、pcDNA3.1-CVB3-2A-2、pcDNA3.1-CVB3-2A-3和pcDNA3.1-CVB3-2A-C。转染细胞,发现区域的缺失不同程度的影响了2A的功能。2A-1、2A-3和2A-C缺失突变体的2A蛋白使得其对eIF4G I的切割功能缺失,而2A-2还保留eIF4G I的切割功能,提示2A-1、2A-3和2A-C缺失的区域是2A蛋白酶发挥切割eIF4G I功能的重要区域。我们的实验结果也发现2A-2缺失突变体对NF-κB p65、IRF7的表达,以及NF-κB和干扰素启动子的功能均具有较强的抑制作用,而2A-1、2A-2、2A-3和2A-C缺失突变体对NF-κB p65、IRF7的表达,以及NF-κB和干扰素启动子的功能影响较小。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 引言11-14
• 实验材料与方法14-28
• 实验结果28-45
• 讨论45-49
• 小结49-50
• 参考文献50-53
• 综述53-63
• 参考文献59-63
• 缩略词对照表63-65
• 个人简历65-67
• 致谢67-68
• 附录68

【共引文献】

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1 付银;常惠芸;刘静;陈慧勇;;口蹄疫病毒与宿主细胞的相互作用研究进展[J];生命科学;2013年11期

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本文编号：327257