胱氨酸的氧化作用对人RANKL胞外结构域构象的研究

发布时间：2017-04-25 22:14

  本文关键词：胱氨酸的氧化作用对人RANKL胞外结构域构象的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：细胞核因子κB受体活化因子配体（Receptor Activator of Nuclear Factor-κ BLigand, RANKL）是RANK/RANKL/OPG系统中的一个II型跨膜受体蛋白，主要表达于破骨细胞前体细胞的表面。RANKL与其受体RANK以六聚体的形式结合并将信号传递至NF-κB,最终促进破骨细胞前体细胞的分化与成熟。RANKL在破骨细胞增殖、分化、活化、存活以及肿瘤细胞凋亡、肿瘤发生、肿瘤转移等一系列生理过程中起着十分重要的作用。本文表达纯化人RANKL胞外结构域蛋白，并研究氧自由基对RANKL胞外结构域构象的影响进而调节RANK/RANKL信号通路。 本研究将人RANKL基因与原核表达载体pET-21b连接并转化至表达菌E．coli Rosetta,构建了人RANKL基因的重组体Rosetta/pET-21b-RANKL，诱导使其表达目的蛋白，并对其表达条件进行了优化。当OD_(600)=0.6时,加入IPTG的终浓度为0.2mM,在20℃振荡诱导培养6h时，甘油浓度为4%时，可在上清中获得较多的RANKL胞外结构域蛋白，为该蛋白的进一步纯化及结构与功能研究打下了基础。在最佳表达条件下得到人重组RANKL胞外结构域蛋白的粗提液，使用Ni亲和层析柱进行分离纯化，经过10mM、40mM、125mM、250mM咪唑洗脱，SDS-PAGE电泳结果表明，经过40mM咪唑洗脱，，得到电泳纯蛋白。蛋白质印迹（western blot）证明了所得的蛋白为RANKL胞外结构域。一级结构分析并结合分子模建表明：RANKL胞外C端结构域(141-317号氨基酸)176个氨基酸，其中含有1个半胱氨酸，在空间位置上，半胱氨酸位于表面，存在被氧化的可能。通过采用内源荧光光谱法、ANS荧光光谱法、圆二色光谱法及SEC分子筛排阻层析法等方法，检测胱氨酸氧化作用对人RANKL胞外结构域的结构变化。研究结果表明，氧化作用导致了RANKL构象变化，并影响其多聚体的形成。提出了“氧化作用影响RANKL的多聚体进而影响六聚体的形成，从而最终影响RANKL/RANK信号通路”的假设。氧化作用引起蛋白结构变化的同时伴随其功能的改变，从而影响聚合体的形成。但具体的机制尚不明确，需要进一步的研究以期能够为RANK/RANKL信号通路药物靶向位点、小分子拮抗物筛选等方面提供新的证据。
【关键词】：RANKL胞外结构域 原核表达 氧化 聚合体 构象变化
【学位授予单位】：湖北师范学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3411
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 缩略词表7-8
• 目录8-10
• 第一章 引言10-17
• 1.1 RANKL 简介10-12
• 1.2 OPG/RANKL／RANK 系统12-13
• 1.3 RANKL 的研究状况及应用前景13-15
• 1.4 本论文研究工作15-17
• 第二章 人 RANKL 胞外结构域表达载体的构建及表达17-35
• 2.1 实验材料和主要仪器17-18
• 2.1.1 实验材料17
• 2.1.2 仪器设备17-18
• 2.2 实验方法18-27
• 2.2.1 人 RANKL 基因模板的确定18
• 2.2.2 感受态细胞的制备18
• 2.2.3 引物设计与合成18-19
• 2.2.4 质粒提取19-20
• 2.2.5 PCR 扩增与回收、酶连20-23
• 2.2.6 转化23
• 2.2.7 重组载体的确认23-24
• 2.2.8 人 RANKL 基因重组表达菌株的构建24
• 2.2.9 重组菌株的原核诱导表达24-27
• 2.3 实验结果27-32
• 2.3.1 RANKL 基因目的片段的扩增27
• 2.3.2 pET-21b-RANKL 表达载体 PCR 和酶切检测27-28
• 2.3.3 重组载体的测序28-29
• 2.3.4 重组菌株的原核诱导表达29
• 2.3.5 重组菌株原核表达条件的优化29-32
• 2.4 讨论32-35
• 2.4.1 表达载体的选择及重组蛋白的表达形式32-33
• 2.4.2 RANKL 蛋白的表达及条件优化33-34
• 2.4.3 人 RANKL 基因原核表达研究展望34-35
• 第三章 胱氨酸对人 RANKL 胞外结构域蛋白构象的研究35-49
• 3.1 引言35-36
• 3.1.1 研究的基础35
• 3.1.2 研究的意义35-36
• 3.1.3 氧化剂的选择36
• 3.2 仪器设备及实验材料36-38
• 3.2.1 主要仪器设备36-37
• 3.2.2 实验材料及试剂37-38
• 3.3 实验方法38-42
• 3.3.1 重组人 RANKL 蛋白的纯化38-39
• 3.3.2 蛋白质印迹（western blot）鉴定重组人 RANKL 胞外结构域39-40
• 3.3.3 蛋白质浓度的计算40
• 3.3.4 光谱学检测氧化作用对重组人 RANKL 胞外结构域蛋白结构变化40-42
• 3.4 实验结果42-47
• 3.4.1 RANKL 镍亲和层析纯化42-43
• 3.4.2 蛋白质印迹鉴定重组人 RANKL 胞外结构域43
• 3.4.3 重组体人 RANKL 胞外结构域蛋白的光谱学检测43-47
• 3.5 讨论47-49
• 致谢49-50
• 参考文献50-56
• 附录1 攻读学位期间发表论文目录56

【参考文献】

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本文编号：327195