miR-186过表达慢病毒载体的构建及鉴定

发布时间：2021-07-12 02:33

　　目的:构建miR-186过表达慢病毒载体并包装慢病毒,探讨miR-186在人胚胎肾细胞(HEK293T细胞系中的感染效率和表达水平。方法:以Hsa-miR-186前体序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增pre-miR-186基因序列,并将其克隆到携带EGFP/Puromycin的慢病毒载体FV040中,经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切及测序鉴定后获得重组慢病毒载体。利用Lipofectamine 2000将重组慢病毒质粒FV040Vector和FV040miR-186分别与辅助质粒通过共转染至HEK293T细胞中,48h后收集慢病毒,以FV040Vector慢病毒作为对照组,FV040miR-186作为实验组,分别感染HEK293T细胞。感染48h后,观察HEK293T细胞中绿色荧光的分布情况,并采用实时荧光定量PCR法检测miR-186的表达水平。结果:测序分析,miR-186过表达慢病毒与GenBank上公布的miR-186序列完全一致。与对照组（0.838 7±0.145 6）比较,实验组HEK 293T细胞中miR-186表达水平（12.640 0±0.788 4）明显升高（t=... 

【文章来源】：吉林大学学报(医学版). 2019,45(05)北大核心CSCD

【文章页数】：7 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 细胞系、质粒、主要试剂和仪器
    1.2 引物序列及合成
    1.3 FV040miR-186过表达质粒的构建、转化及鉴定
    1.4 miR-186过表达慢病毒的包装
    1.5 miR-186过表达慢病毒的收集及浓缩
    1.6 miR-186过表达慢病毒感染HEK293T细胞
    1.7 实时荧光定量PCR法检测HEK293T细胞中miR-186表达水平
    1.8 统计学分析
2 结果
    2.1 miR-186过表达慢病毒载体图谱的构建
    2.2 miR-186过表达慢病毒在HEK293T细胞中的感染效率
    2.3 实时荧光定量PCR法检测HEK293T细胞中miR-186表达水平
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
[1]基于高通量测序的肝癌circRNA-miRNA-mRNA调控网络构建及功能富集分析[J]. 赵静,杨兴武,李京涛,王旗,王亮,王国泰.  临床肝胆病杂志. 2019(08)
[2]慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白筛选稳定转染的兔骨髓间充质干细胞[J]. 李琦,邹志余,杨瑞泽,邓洪利,张蕊,周劲松.  西安交通大学学报(医学版). 2019(04)



本文编号：3279014