骨形成发生蛋白-2协同刺激钛颗粒诱导下的破骨细胞生成

发布时间：2017-04-26 09:19

  本文关键词：骨形成发生蛋白-2协同刺激钛颗粒诱导下的破骨细胞生成，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：探讨骨形态发生蛋白-2（BMP-2）在磨粒诱导小鼠RAW264.7细胞分化成破骨细胞中的作用。。 方法：1.将小鼠RAW264.7细胞培养于六孔板中，分别加入BMP-2蛋白，钛颗粒，，BMP-2蛋白和钛颗粒进行培养，利用免疫组化，实时定量，免疫印迹等手段对分化的破骨细胞进行检测。2.以腺病毒为基础将TNF-siRNA克隆入pSilencer2.1-hU6载体中，经PCR扩增后克隆入pGEMT载体，随后克隆入pAd5E1-MCS-CMVeGFP，形成带有绿色荧光标记的重组腺病毒Ad-TNF-siRNA；将带有BMP-2的pCDNA3.1载体克隆入pAd5E3-CMV穿梭质粒中，然后克隆入pAd5骨架，经扩增后将带有TNF-siRNA的腺病毒骨架和带有BMP-2的骨架经PacI酶切线性化后转染HEK293细胞，最终形成重组腺病毒Ad-BMP-2-TNF-α-siRNA。3.将Ad-TNF-siRNA和Ad-BMP-2-TNF-α-siRNA分别加入含有钛颗粒的RAW264.7细胞中，与只加入钛颗粒的细胞做对比，利用免疫组化，免疫印迹，实时定量等手段对分化的破骨细胞进行检测。 结果：在本实验中我们发现BMP-2能够协同钛颗粒刺激小鼠RAW264.7细胞的分化。低浓度的BMP-2（30,50ng/ml）在刺激破骨细胞分化的大小，数量，细胞核数量，破骨细胞标志因子及骨吸收面积上都达到最佳刺激浓度，本实验还表明在破骨细胞分化早期，BMP-2能够促进c-fos与磷酸化的SMAD1/5/8的表达。BMP-2和钛颗粒能够协同刺激p-JNK,p-P38，p-IkB及p50的表达。同时我们利用腺病毒构建携带TNF-α-siRNA（Ad-TNF-siRNA）和同时携带TNF-α-siRNA与BMP-2（Ad-BMP2-TNFsiRNA）的载体，将其转染加入钛颗粒的RAW264.7细胞中，发现两个载体都能抑制TNF-α的表达，但只有Ad-TNF-siRNA能够显著抑制小鼠破骨细胞的分化，而Ad-BMP2-TNFsiRNA能够增加破骨细胞分化的大小，数量，细胞核数量，破骨细胞标志因子的表达及骨吸收面积的大小，并且其诱导破骨细胞分化水平与钛颗粒诱导RAW264.7细胞分化成破骨细胞的水平相似。同时Ad-BMP2-TNFsiRNA能够提高早期破骨细胞分化标志基因c-Fos的表达，增强p-JNK和p-P38信号通路的表达。 结论：本实验通过探讨骨形态发生蛋白-2（BMP-2）在磨粒诱导小鼠RAW264.7细胞分化成破骨细胞中的作用。发现BMP-2能够协同钛颗粒刺激小鼠RAW264.7细胞的分化，通过激活p-JNK，p-P38和p-IkB信号通路，从而显著提高破骨细胞分化的大小，数量，细胞核的数量及骨吸收的面积。并且BMP-2提高破骨细胞的分化能力不受磨粒及其刺激产物TNF-α的影响。本实验显示BMP-2在磨粒诱导破骨细胞的分化中占有关键地位。
【关键词】：骨形态发生蛋白-2 钛颗粒 破骨细胞 腺病毒 肿瘤坏死因子
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 前言10-18
• 对象和方法18-31
• 1. 细胞培养18-19
• 2. 钛颗粒的处理19
• 3. 细胞活性检测19
• 4. 耐酒石酸盐酸性磷酸酶（TRAP）检测19-20
• 5. 骨吸收水平检测20
• 6. ELISA20
• 7. 实时定量 PCR20-22
• 8. 免疫印迹（Western blot）22-23
• 9. 腺病毒载体的构建23-30
• 10. 统计学方法30-31
• 结果31-41
• 讨论41-48
• 结论48-49
• 参考文献49-56
• 文献综述56-67
• 综述参考文献64-67
• 致谢67-68
• 攻读学位期间发表的学术论文68

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本文编号：328185