高致病性2型猪链球菌Ⅳ型分泌系统效应分子的筛选与功能研究

发布时间：2017-04-26 11:01

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【摘要】：猪链球菌(Streptococcus suis, S.suis)为革兰阳性球菌，根据其荚膜多糖的差异可以分为35个血清型，其中2型猪链球菌(S.suis2，SS2)致病力最强，分布最为广泛。SS2是一种重要的人畜共患病原体。它的主要感染宿主是猪，SS2感染现已成为最为重要的猪传染病之一，每年给全世界养猪业带来了巨大的经济损失。此外，SS2还能通过伤口和呼吸道等传播途径感染人，引起急性脑膜炎、肺炎、关节炎、败血症等。因此，也对相关从业人员的健康构成了严重的威胁。既往报道人感染SS2病例多为散发，但1998年和2005年我国江苏和四川先后暴发两起大规模人群SS2感染疫情，部分感染病人短期内出现高热、低血压休克、多器官功能衰竭等症状，病情极为凶险，病死率极高，为国内外首次报道的由非A群链球菌引起的大规模链球菌中毒性休克综合征(streptococcal toxic shock syndrome, STSS)，给公共卫生安全带来了极大的威胁。 SS2致病机制较为复杂，至今尚未完全阐明。陈晨等人通过比较基因组学发现，引起我国两次暴发流行的代表菌株98HAH12和05ZYH33与SS2标准菌株相比，高致病性SS2含有一个89K毒力岛(pathogenicity island, PAI)，相关研究结果高度提示该毒力岛与流行菌株的高致病性密切相关。本课题组前期研究发现，89K毒力岛的5’端含有一段编码Ⅳ型分泌系统(Type Ⅳ secretion system，T4SS)的基因簇。T4SS广泛分布于革兰阴性细菌和阳性细菌，它能够介导效应分子的跨膜转运，并将其分泌至宿主细胞或胞外环境，参与细菌的致病过程。本课题组前期研究结果提示，高致病性SS2的T4SS很可能通过分泌某种效应分子，参与细菌的致病过程，引发STSS。因此，找到T4SS的效应分子并对其功能进行深入研究，对于阐明高致病性SS2引发STSS的机制具有重要意义。 为此，本课题首先通过蛋白质组学技术，寻找SS2野生株与T4SS关键组分缺失突变株的差异分泌蛋白，筛选出T4SS的效应分子。然后分别在转录水平、效应蛋白分泌水平以及蛋白质相互作用水平对效应分子SspA进行了验证。最后通过构建效应分子基因缺失突变株，观察其对细菌毒力以及刺激机体产生炎症因子的能力的影响。主要实验内容和结果如下： 1.T4SS效应分子的筛选：TCA-丙酮沉淀法获得SS205ZYH33野生株以及T4SS关键组分基因缺失突变株培养上清中的分泌蛋白。通过LC-MS/MS技术，应用质谱鸟枪法(shot-gun)策略鉴定上清分泌蛋白，获得两株细菌的分泌蛋白谱，通过分析比较寻找差异蛋白，从而筛选出T4SS相关的可疑分泌蛋白即候选的效应分子。在本实验中，我们筛选到了7个候选效应分子。7个候选效应蛋白中包括两个类枯草杆菌丝氨酸蛋白酶(SspA)，三个ABC转运系统相关蛋白，一个脯氨酰-tRNA合成酶以及一个假定蛋白。根据文献报道和实际情况我们选择了其中得分最高的05SSU1982蛋白(SspA)进行了深入的研究。 2.效应分子转录水平的验证：提取对数后期SS2野生株05ZYH33和T4SS关键组分缺失突变株(virD4、 virB1以及virB4) mRNA，通过逆转录定量PCR的方法对各菌株sspA基因的转录水平进行比较。结果表明各菌株sspA基因的转录无显著差异，说明在T4SS关键组分缺失的突变株培养上清中检测不到SspA的分泌并不是由于T4SS组分的缺失影响了sspA基因的转录。 3.效应分子分泌水平的验证：通过大肠杆菌、pET28a表达系统以及镍亲和层析、离子交换层析的纯化方法表达纯化含SspA主要结构域片段的重组蛋白，然后用获得的纯度较高的蛋白免疫小鼠，制备含SspA多克隆抗体的免疫血清，最后通过该免疫血清检测比较SS2各菌株分泌上清中的效应分子SspA，Western blot结果证实T4SS介导了效应分子SspA的分泌，与质谱检测结果吻合。 4.T4SS组分VirD4与效应分子SspA相互作用的验证：通过pGEX-6p-1载体表达纯化GST-VirD4融合蛋白，并以它作为诱饵，通过Pull-down实验验证它与效应分子SspA之间是否存在相互作用。结果证实SspA蛋白与T4SS效应分子偶联蛋白VirD4之间存在直接的相互作用，也是SspA蛋白作为T4SS效应分子的有力证据。 5.T4SS效应分子的功能研究：运用基因同源重组技术构建sspA基因缺失突变的SS2，，对效应分子SspA的功能进行研究。通过BALB/c小鼠感染模型证实了sspA基因缺失的SS2对小鼠的致病性减弱，同时，ELISA炎症因子检测实验表明效应分子基因缺失突变株刺激小鼠产生炎症因子的能力大大降低。 综上所述，本研究通过蛋白组学方法筛选出了T4SS的效应分子。并分别在转录水平、效应蛋白分泌水平以及蛋白质相互作用水平对其进行了验证，证实了SspA蛋白确为T4SS的效应分子。最后通过构建sspA基因缺失突变株以及动物攻毒实验证实了sspA基因缺失的SS2对小鼠的致病性减弱以及刺激小鼠产生炎症因子的能力大大降低。说明T4SS效应分子SspA能够诱导小鼠炎症因子分泌，在高致病性SS2引发的STSS中发挥了重要作用。
【关键词】：2型猪链球菌 Ⅳ型分泌系统 效应分子 链球菌中毒性休克综合征
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378
【目录】：

• 缩略语表6-8
• Abstract8-11
• 摘要11-14
• 第一章 前言14-18
• 第二章 T4SS 效应分子的筛选18-27
• 2.1 引言18-19
• 2.2 试剂与材料19-21
• 2.3 实验方法21-23
• 2.4 实验结果23-25
• 2.5 讨论25-27
• 第三章 T4SS 效应分子的验证27-58
• 3.1 效应分子转录水平的验证27-32
• 3.1.1 引言27
• 3.1.2 试剂与材料27-28
• 3.1.3 实验方法28-30
• 3.1.4 实验结果30-31
• 3.1.5 讨论31-32
• 3.2 效应分子分泌水平的验证32-49
• 3.2.1 引言32
• 3.2.2 sspA 基因的克隆、表达及纯化32-40
• 3.2.2.1 试剂与材料33-34
• 3.2.2.2 实验方法34-37
• 3.2.2.3 实验结果37-40
• 3.2.2.4 讨论40
• 3.2.3 SspA 蛋白免疫血清的制备40-45
• 3.2.3.1 试剂与材料40-41
• 3.2.3.2 实验方法41-43
• 3.2.3.3 实验结果43-44
• 3.2.3.4 讨论44-45
• 3.2.4 胞外效应分子的检测45-49
• 3.2.4.1 试剂与材料45-46
• 3.2.4.2 实验方法46-47
• 3.2.4.3 实验结果47-48
• 3.2.4.4 讨论48-49
• 3.3 T4SS 组分 VirD4 与效应分子相互作用的验证49-58
• 3.3.1 引言49-50
• 3.3.2 试剂与材料50-51
• 3.3.3 实验方法51-54
• 3.3.4 实验结果54-56
• 3.3.5 讨论56-58
• 第四章 T4SS 效应分子的功能研究58-74
• 4.1 引言58
• 4.2 T4SS 效应分子 sspA 基因敲除株的构建58-65
• 4.2.1 试剂与材料58-59
• 4.2.2 实验方法59-62
• 4.2.3 实验结果62-64
• 4.2.4 讨论64-65
• 4.3 sspA 菌株毒力改变分析65-69
• 4.3.1 试剂与材料66
• 4.3.2 实验方法66-67
• 4.3.3 实验结果67-68
• 4.3.4 讨论68-69
• 4.4 sspA 菌株致炎能力改变分析69-74
• 4.4.1 试剂与材料69-70
• 4.4.2 实验方法70-71
• 4.4.3 实验结果71-72
• 4.4.4 讨论72-74
• 全文总结74-75
• 参考文献75-83
• 文献综述83-102
• 参考文献95-102
• 攻读硕士期间发表的文章102-103
• 致谢103

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 陈巍;杨勇军;;细菌的Ⅶ型分泌系统研究进展[J];中国兽医学报;2013年09期

2 张永宁;吴绍强;林祥梅;;施马伦贝格病研究进展[J];畜牧兽医学报;2014年07期

3 张永宁;吴绍强;吕继洲;冯春燕;王彩霞;邓俊花;袁向芬;林祥梅;;检测施马伦贝格病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法[J];畜牧兽医学报;2014年11期

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1 郝彬;鳗弧菌Ⅵ型分泌系统（T6SS）的功能及调控研究[D];中国科学院研究生院（海洋研究所）;2012年

2 袁增智;猪链球菌毒力相关蛋白HP0197的结构生物学研究以及喹诺酮耐药相关基因突变研究[D];华中农业大学;2013年

3 张丽R

本文编号：328285