霍乱弧菌CRP的碳源利用与甘露醇发酵转录水平的研究

发布时间：2017-04-26 17:14

  本文关键词：霍乱弧菌CRP的碳源利用与甘露醇发酵转录水平的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的研究霍乱弧菌中CRP（cAMP receptor protein）调节蛋白、环腺苷酸受体蛋白（cAMP receptor protein CRP）对高丝氨酸脱氢（homoserine dehydrogenaseisozymes, HDH）是否具有调控作用。 CRP蛋白在调节多个通路，特别是在碳源代谢中发挥重要作用，同时CRP-cAMP亦调控着霍乱弧菌甘露醇mtl操纵子，其中mtl操纵子主要是霍乱弧菌O1群El Tor型产毒株（主要为甘露醇慢发酵株）和非产毒株（主要为甘露醇快发酵株）的调控因子。研究霍乱弧菌甘露醇发酵基因mtlA、mtlD转录水平差别，用实验数据证实两种类型菌株对甘露醇发酵快慢的原理。在试验中比较霍乱弧菌El Tor型的产毒株与非产毒株两类菌株在甘露醇发酵液试验中操纵子基因mtA、mtlD的RNA转录水平差异，它是否普遍存在于不同年代和不同地区的菌株中，及其蛋白表达是否也具有相同的差异性。 方法采用基因搭桥与菌株构建的方法。通过搭桥PCR将HDH基因启动子中CRP潜在结合位点替换为CRP保守结合位点，分别将替换前后的启动子序列导入报告质粒，转化到野生珠C7258及CRP缺失株WL7258中比较冷光值的差异。霍乱弧菌中mtl基因簇调控甘露醇发酵的结构基因是mtlCBA，检测不同年代与不同地区的菌株，对24株甘露醇快发酵菌株和24株甘露醇慢发酵菌株在甘露醇发酵液中提取RNA，选取3个时间点（0.5h，2h，4h）检测mtlCBA基因转录，用Real-time荧光定量PCR的方法，比较两类菌株中甘露醇操纵子mtA，mtlD基因转录水平在培养发酵液过程中RNA的差异。另外，利用WB（western）实验技术，提取总蛋白，观察两类菌株mtlD基因在甘露醇发酵液中的蛋白表达差异。 结果改造前报告质粒在野生株中的冷光值高于CRP缺失株，改造后报告质粒的冷光值在两株菌中均有升高，但在野生株中的升高值更为明显。试验中随机挑选24株甘露醇慢发酵株和24株甘露醇快发酵株，检测这两种类型的菌株在甘露醇发酵试验中，甘露醇操纵子mtlCBA的RNA转录水平的差异，，经比较， RNA转录水平在早期，甘露醇快发酵株mtlCBA高于甘露醇慢发酵株；且甘露醇快速发酵株的操纵子mtlD基因蛋白表达量也高于甘露醇慢发酵株。 结论霍乱弧菌的受体蛋白CRP调控HDH的转录，但不是唯一调控因子，霍乱弧菌两种菌株甘露醇PTS操纵子的转录差异，是启动子活性水平流行和非流行株甘露醇发酵菌株差异的原因。
【关键词】：霍乱弧菌 CRP 甘露醇 转录
【学位授予单位】：河北联合大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文缩略表10-11
• 引言11-14
• 第1章 霍乱弧菌 CRP 的碳源利用与甘露醇转录差异14-42
• 1.1 材料14-20
• 1.1.1 主要仪器与试剂14-15
• 1.1.2 培养基与培养条件15-17
• 1.1.3 菌株与质粒17-20
• 1.2 方法20-29
• 1.2.1 CRP 结合位点预测与搭桥20-21
• 1.2.2 质粒构建21-22
• 1.2.3 感受态细胞的制备及转化试验22
• 1.2.4 接合转移22
• 1.2.5 冷光值的测定22-23
• 1.2.6 核酸操作技术23-25
• 1.2.7 Total RNA 的提取25-26
• 1.2.8 Ambion，s DNA-freeTM 消除 DNA 污染26
• 1.2.9 逆转录试验与 RT-PCR26-27
• 1.2.10 WB 操作试验27-29
• 1.3 结果29-34
• 1.3.1 CRP 结合位点预测与搭桥29
• 1.3.2 质粒构建29-31
• 1.3.3 报告质粒在不同菌株中冷光值的测定31
• 1.3.4 提取 RNA 的质量31-32
• 1.3.5 菌株在甘露醇中的转录差异32-33
• 1.3.6 菌株在甘露醇液中的蛋白表达差异33-34
• 1.4 讨论34-37
• 1.4.1 霍乱弧菌中 CRP 对高丝氨酸脱氢酶基因的调控作用34-36
• 1.4.2 霍乱弧菌甘露醇发酵 mRNA 转录和蛋白表达水平36-37
• 1.5 结论37-38
• 参考文献38-42
• 第2章 综述 霍乱弧菌 CRP 对甘露醇代谢的研究进展42-52
• 2.1 霍乱弧的基本特性42-45
• 2.1.1 霍乱弧菌流行特征与致病机制42-43
• 2.1.2 霍乱弧菌的鉴定与分型43-45
• 2.2 霍乱弧菌 CRP 对甘露醇的影响45-48
• 2.2.1 CRP 蛋白在细菌中的研究45-46
• 2.2.2 霍乱弧菌中受 CRP 调节的基因46-48
• 2.2.3 CRP 未来应用48
• 参考文献48-52
• 致谢52-53
• 导师简介53-54
• 作者简介及在学成果54-56
• 学位论文数据集56

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 金大智;张政;罗芸;叶菊莲;程苏云;吴方;金郁;;多重荧光定量PCR甄别3种霍乱弧菌相关毒素基因[J];中国人兽共患病学报;2011年12期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 张红芝;El Tor型霍乱弧菌中甘露醇和山梨醇代谢机制研究[D];中国疾病预防控制中心;2009年

  本文关键词：霍乱弧菌CRP的碳源利用与甘露醇发酵转录水平的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：328895