重组SSB蛋白表达、鉴定及评价

发布时间：2021-07-20 13:17

　　目的构建SSB蛋白原核表达质粒,在大肠埃希菌中诱导表达后进行纯化。方法以Hela细胞提取RNA后逆转录的cDNA为模板,利用聚合酶链反应（PCR）扩增出带酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ的人SSB蛋白基因序列,经酶切后插入PET41a质粒中,构建成GST-SSB-6*His-pet41a重组表达质粒,转化入感受态大肠埃希菌OverExpress C41（DE3）中,经异丙基β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达,利用C端的His标签（Histag）进行Ni-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达形式,蛋白印迹法（WB）鉴定重组蛋白的免疫原性,酶联免疫吸附试验（ELISA）鉴定其免疫反应性和特异性。结果 PCR扩增获得目的基因,菌落PCR示重组表达质粒构建成功,转化感受态OverExpress C41（DE3）后经诱导有高效表达,SDS-PAGE显示GST-SSB-6*His重组蛋白为上清可溶性表达,WB示重组蛋白有足够的免疫原性,能与外周血中的抗SSB抗体发生特异性反应,特异性达100%。结论成功构建了GST-SSB-6*His-PET41a重组表达质粒,经诱导表达后可纯化出目... 

【文章来源】：重庆医学. 2019,48(14)

【文章页数】：5 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 一般资料
    1.2 试剂
    1.3 方法
        1.3.1 引物设计、合成与PCR扩增
        1.3.2 重组质粒的构建
        1.3.3 SSB重组蛋白的表达形式
        1.3.4 GST-SSB-6*His重组蛋白的纯化
        1.3.5 GST-SSB-6*His重组蛋白免疫原性验证
        1.3.6 GST-SSB-6*His重组蛋白用于ELISA检测抗SSB抗体
        1.3.7 重组蛋白特异性验证
2 结果
    2.1 PCR扩增结果
    2.2 重组质粒的菌落PCR及测序鉴定结果
    2.3 诱导表达和纯化
        2.3.1 重组蛋白表达形式鉴定
        2.3.2 重组蛋白大量表达后纯化
        2.3.3 重组蛋白免疫原性鉴定
        2.3.4 重组蛋白用于ELISA检测抗SSB抗体
        2.3.5 特异性鉴定
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
[1]2015年全国多中心自身抗体检测质量调查评价[J]. 胡朝军,张蜀澜,邓垂文,李梦涛,曾小峰.  中华临床免疫和变态反应杂志. 2016(02)
[2]重视自身抗体检测质量管理和临床应用[J]. 胡朝军,李永哲.  中华检验医学杂志. 2013 (08)



本文编号：3292896