PAX6通过PI3K/AKT信号通路抑制mESCs增殖的研究
发布时间：2021-08-05 03:27
目的探讨PAX6对小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）增殖的影响及其机制。方法用过表达PAX6慢病毒重组质粒载体感染mESCs,上调mESCs中PAX6的表达;采用CCK8检测PAX6对mESCs增殖的影响;采用流式细胞仪检测PAX6对mESCs周期的影响;采用葡萄糖生化试剂盒和ATP检测试剂盒分别检测mESCs葡萄糖和ATP含量;Western blot检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-P70S6K、P70S6K、GLUT1的表达。结果慢病毒重组质粒载体感染后,PAX6过表达组mESCs较对照组PAX6表达增加,细胞增殖受到抑制,并出现G1期阻滞（二倍体含量百分率55.54±1.00%vs 41.12±0.63%,P<0.05）;与对照组比较,PAX6过表达减少mESCs中ATP（277.7±14.3 vs 804.4±13.4 umol/gprot,P<0.05）及葡萄糖含量（2.55±0.16 vs 5.16±0.15 mmol/L,P<0.05）;与对照组相比,PAX6过表达组、...
【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2019,14(08)北大核心CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
图１培养的ｍＥＳＣｓ光镜下形态（１００×）ＡｍＥＳＣｓｃｅｌｌｓｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎＭＥＦｆｅｅｄｉｎｇｌａｙｅｒＢｍＥＳＣｓｃｅｌｌｓｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｏｕｔＭＥＦｆｅｅｄｅｒｌａｙｅｒＣａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＰ）ｓｔａｉｎｉｎｇｏｆＡ含ＭＥＦ饲养层培养的ｍＥＳＣｓＢ脱ＭＥＦ饲养层培养的ｍＥＳＣｓＣｍＥＳＣｓ碱性磷酸酶（ＡＰ）
ｓ．Ｆｉｇ．１ＭｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｍＥＳＣｓｕｎｄｅｒｌｉｇｈｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（１００×）图２显示，使用单克隆抗体ＳＳＥＡ１ｍｏｕｓｅｍＡｂ加ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＩｇＧ－ＣＹ３，ＯＣＴ４ｒａｂｂｉｔｍＡｂ加ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔＩｇＧ－ＣＹ３染色后，可见ｍＥＳＣｓ胞质内有ＯＣＴ４表达（红色荧光），细胞胞膜有ＳＳＥＡ１表达（红色荧光）。表明ｍＥＳＣｓ仍处于未分化状态，具有多能性，具备胚胎干细胞的特征。图２ｍＥＳＣｓ免疫荧光染色检查ＯＣＴ４及ＳＳＥＡ１的表达Ｆｉｇ．２ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＯＣＴ４ａｎｄＳＳＥＡ１ｗｉｔｈｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇｉｎｍＥＳＣｓ２ＰＡＸ６对细胞增殖的影响２．１ＰＡＸ６的过表达为研究ＰＡＸ６在ｍＥＳＣｓ中的作用，采用慢病毒重组质粒载体感染ｍＥＳＣｓ的方法上调ｍＥＳＣｓ中ＰＡＸ６的表达。如图３所示，ＰＡＸ６过表达组ｍＥＳＣｓ中可见ＰＡＸ６表达（红色荧光），对照组与过表达空载体组未见ＰＡＸ６荧光表达，过表达空载体组与ＰＡＸ６过表达组可见ＧＦＰ绿色荧光。采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测各组ｍＥＳＣｓ中ＰＡＸ６的表达，结果·１９６·中国病原生物学杂志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ２０１９年８月第１４卷第８期Ａｕｇ．２０１９，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．８
见图４。过表达组ＰＡＸ６蛋白表达较对照组和过表达空载体组明显增加，ｍＥＳＣｓ感染ＰＡＸ６过表达载体成功。图３ｍＥＳＣｓ免疫荧光染色中ＰＡＸ６及ＧＦＰ的表达Ｆｉｇ．３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＡＸ６ａｎｄＧＦＰｗｉｔｈｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇｉｎｍＥＳＣｓ图４Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＰＡＸ６蛋白相对表达量Ｆｉｇ．４ＲｅｌａｔｉｖｅｌｙｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＡＸ６２．２ＰＡＸ６对ｍＥＳＣｓ增殖的影响采用ＣＣＫ８法测定ＰＡＸ６对ｍＥＳＣｓ增殖能力的影响，结果见图５。在２４ｈ及４８ｈ两个时间点均观察到ＰＡＸ６过表达抑制ｍＥＳＣｓ的增殖。提示ＰＡＸ６具有抑制ｍＥＳＣｓ增殖的作用。２．３流式细胞术检测ＰＡＸ６对ｍＥＳＣｓ周期的影响流式细胞术检测结果见图６。与对照组相比，ＰＡＸ６过表达组ｍＥＳＣｓ出现Ｇ１期阻滞，过表达空载组与对照组之间无明显不同。图５ＣＣＫ８法测ｍＥＳＣｓ增殖情况Ｆｉｇ．５ＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｍＥＳＣｓｃｅｌｌｓＡｍＥＳＣｓ流式细胞术图Ｂ３组细胞二倍体含量比较图６ＰＡＸ６对ｍＥＳＣｓ细胞周期的影响ＡＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｏｆｍＥＳＣｓＢＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆ２－ｐｌｏｉｄｙｃｏｎｔｅｎｔｉｎａｌｌｇｒｏｕｐｓＦｉｇ．６ＥｆｆｅｃｔｏｆＰＡＸ６ｏｎｍＥＳＣｓｃｅｌｌｃｙｃｌｅ３ＰＡＸ６干扰能量代谢作用３．１ＰＡＸ６对ｍＥＳＣｓ中ＡＴＰ和葡萄糖含量的影响分别采用ＡＴ
【参考文献】：
期刊论文
[1]靶向沉默Pax6基因表达抑制视网膜母细胞瘤增殖侵袭的机制研究[J]. 祁海燕,冷非,苏学刚. 临床和实验医学杂志. 2017(16)
[2]Limbal stem cells: Central concepts of corneal epithelial homeostasis[J]. Jinny J Yoon,Salim Ismail,Trevor Sherwin. World Journal of Stem Cells. 2014(04)
博士论文
[1]替莫唑胺通过调控miR-223/PAX6抑制胶质瘤细胞增殖的研究[D]. 程全.中南大学 2014
本文编号：3322970
【文章来源】：中国病原生物学杂志. 2019,14(08)北大核心CSCD
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
图１培养的ｍＥＳＣｓ光镜下形态（１００×）ＡｍＥＳＣｓｃｅｌｌｓｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎＭＥＦｆｅｅｄｉｎｇｌａｙｅｒＢｍＥＳＣｓｃｅｌｌｓｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｏｕｔＭＥＦｆｅｅｄｅｒｌａｙｅｒＣａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＰ）ｓｔａｉｎｉｎｇｏｆＡ含ＭＥＦ饲养层培养的ｍＥＳＣｓＢ脱ＭＥＦ饲养层培养的ｍＥＳＣｓＣｍＥＳＣｓ碱性磷酸酶（ＡＰ）
ｓ．Ｆｉｇ．１ＭｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｍＥＳＣｓｕｎｄｅｒｌｉｇｈｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（１００×）图２显示，使用单克隆抗体ＳＳＥＡ１ｍｏｕｓｅｍＡｂ加ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＩｇＧ－ＣＹ３，ＯＣＴ４ｒａｂｂｉｔｍＡｂ加ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔＩｇＧ－ＣＹ３染色后，可见ｍＥＳＣｓ胞质内有ＯＣＴ４表达（红色荧光），细胞胞膜有ＳＳＥＡ１表达（红色荧光）。表明ｍＥＳＣｓ仍处于未分化状态，具有多能性，具备胚胎干细胞的特征。图２ｍＥＳＣｓ免疫荧光染色检查ＯＣＴ４及ＳＳＥＡ１的表达Ｆｉｇ．２ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＯＣＴ４ａｎｄＳＳＥＡ１ｗｉｔｈｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇｉｎｍＥＳＣｓ２ＰＡＸ６对细胞增殖的影响２．１ＰＡＸ６的过表达为研究ＰＡＸ６在ｍＥＳＣｓ中的作用，采用慢病毒重组质粒载体感染ｍＥＳＣｓ的方法上调ｍＥＳＣｓ中ＰＡＸ６的表达。如图３所示，ＰＡＸ６过表达组ｍＥＳＣｓ中可见ＰＡＸ６表达（红色荧光），对照组与过表达空载体组未见ＰＡＸ６荧光表达，过表达空载体组与ＰＡＸ６过表达组可见ＧＦＰ绿色荧光。采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测各组ｍＥＳＣｓ中ＰＡＸ６的表达，结果·１９６·中国病原生物学杂志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ２０１９年８月第１４卷第８期Ａｕｇ．２０１９，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．８
见图４。过表达组ＰＡＸ６蛋白表达较对照组和过表达空载体组明显增加，ｍＥＳＣｓ感染ＰＡＸ６过表达载体成功。图３ｍＥＳＣｓ免疫荧光染色中ＰＡＸ６及ＧＦＰ的表达Ｆｉｇ．３ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＡＸ６ａｎｄＧＦＰｗｉｔｈｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｔａｉｎｉｎｇｉｎｍＥＳＣｓ图４Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＰＡＸ６蛋白相对表达量Ｆｉｇ．４ＲｅｌａｔｉｖｅｌｙｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＡＸ６２．２ＰＡＸ６对ｍＥＳＣｓ增殖的影响采用ＣＣＫ８法测定ＰＡＸ６对ｍＥＳＣｓ增殖能力的影响，结果见图５。在２４ｈ及４８ｈ两个时间点均观察到ＰＡＸ６过表达抑制ｍＥＳＣｓ的增殖。提示ＰＡＸ６具有抑制ｍＥＳＣｓ增殖的作用。２．３流式细胞术检测ＰＡＸ６对ｍＥＳＣｓ周期的影响流式细胞术检测结果见图６。与对照组相比，ＰＡＸ６过表达组ｍＥＳＣｓ出现Ｇ１期阻滞，过表达空载组与对照组之间无明显不同。图５ＣＣＫ８法测ｍＥＳＣｓ增殖情况Ｆｉｇ．５ＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｍＥＳＣｓｃｅｌｌｓＡｍＥＳＣｓ流式细胞术图Ｂ３组细胞二倍体含量比较图６ＰＡＸ６对ｍＥＳＣｓ细胞周期的影响ＡＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｏｆｍＥＳＣｓＢＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆ２－ｐｌｏｉｄｙｃｏｎｔｅｎｔｉｎａｌｌｇｒｏｕｐｓＦｉｇ．６ＥｆｆｅｃｔｏｆＰＡＸ６ｏｎｍＥＳＣｓｃｅｌｌｃｙｃｌｅ３ＰＡＸ６干扰能量代谢作用３．１ＰＡＸ６对ｍＥＳＣｓ中ＡＴＰ和葡萄糖含量的影响分别采用ＡＴ
【参考文献】：
期刊论文
[1]靶向沉默Pax6基因表达抑制视网膜母细胞瘤增殖侵袭的机制研究[J]. 祁海燕,冷非,苏学刚. 临床和实验医学杂志. 2017(16)
[2]Limbal stem cells: Central concepts of corneal epithelial homeostasis[J]. Jinny J Yoon,Salim Ismail,Trevor Sherwin. World Journal of Stem Cells. 2014(04)
博士论文
[1]替莫唑胺通过调控miR-223/PAX6抑制胶质瘤细胞增殖的研究[D]. 程全.中南大学 2014
本文编号：3322970
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