FKBP25及其缺失突变体与CLIC1相互作用的研究

发布时间：2017-04-28 23:00

  本文关键词：FKBP25及其缺失突变体与CLIC1相互作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的为进一步了解哺乳动物细胞中FKBP25蛋白的生物学功能，构建下游带FLAG标签的FKBP25缺失突变体FKBP25-FLAG-N和FKBP25-FLAG-C真核表达质粒。分别将FKBP25及两个缺失突变体表达质粒转染至COS7细胞中，观察各组蛋白单独表达时在细胞内的定位情况；分别将带不同标签的FKBP25与CLIC1表达质粒共转染至COS7细胞和HEK293T细胞中，通过免疫荧光方法观察各组蛋白在细胞内的共定位情况；免疫共沉淀方法检测各组蛋白在细胞内的相互作用情况。 方法以pCDNA3.1-FKBP25-FLAG重组质粒为模板，用PCR方法构建pCDNA3.1-FKBP25-FLAG-N和pCDNA3.1-FKBP25-FLAG-C真核表达质粒。重组质粒经双酶切鉴定正确后送去测序。采用脂质体法进行细胞转染，将带不同标签的FKBP25和CLIC1质粒单独转染至COS7细胞中，利用细胞免疫荧光技术研究各组蛋白单转定位变化；将pCDNA3.1-FKBP25-FLAG及两个缺失突变体、pCDGFP-FKBP25质粒分别与带不同标签CLIC1质粒共转染至COS7细胞中，在荧光显微镜下观察各组蛋白在哺乳动物细胞内共定位情况；分别将pCDGFP-FKBP25、pCDNA3.1-FKBP25-FLAG两个缺失突变体质粒和带不同标签的CLIC1质粒共转染至HEK293T细胞中，通过免疫共沉淀方法检测FKBP25及两个缺失突变体蛋白与CLIC1蛋白在哺乳动物细胞内的是否相互作用。 结果经酶切和测序结果鉴定，重组质粒构建成功。免疫荧光显微镜观察FKBP25蛋白主要分布在细胞质，细胞核也有一定分布；两个缺失突变体蛋白的定位没有变化。CLIC1蛋白主要分布在细胞核，核膜处也有分布，细胞质内次之。共定位观察FKBP25及两个缺失突变体蛋白与CLIC1蛋白在COS7细胞中主要分布在细胞质，核膜及细胞核内少量分布。免疫共沉淀检测FKBP25及pCDNA3.1-FKBP25-FLAG-N蛋白和CLIC1蛋白在HEK293T细胞中存在相互作用。 结论在COS7细胞中，，FKBP25及两个缺失突变体蛋白与CLIC1蛋白存在部分共定位；免疫共沉淀实验进一步显示在HEK293T细胞中， FKBP25及pCDNA3.1-FKBP25-FLAG-N蛋白与CLIC1蛋白存在相互作用；pCDNA3.1-FKBP25-FLAG-C蛋白与CLIC1蛋白不存在相互作用。
【关键词】：FKBP25 缺失突变体 CLIC1 共定位 免疫共沉淀 蛋白质相互作用
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363
【目录】：

• 主要英文缩写词一览表5-7
• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 1 前言11-13
• 2 材料与方法13-32
• 3 实验结果32-43
• 4 讨论43-45
• 5 结论45-46
• 6 对本课题的展望46
• 参考文献46-52
• 附录52-53
• 致谢53-54
• 综述54-62
• 参考文献60-62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 程海鹏,明镇寰,王君晖;肽基脯氨酰异构酶在细胞核内的功能[J];生命的化学;1999年03期

2 戴寒晶;刘晓颖;钟子琳;范礼斌;;酵母双杂交技术筛选胞内氯离子通道蛋白1结合蛋白[J];安徽医科大学学报;2006年02期

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本文编号：333687