新型隐球菌FQ-PCR检测体系在血流感染大鼠模型的应用研究

发布时间：2017-04-29 01:01

  本文关键词：新型隐球菌FQ-PCR检测体系在血流感染大鼠模型的应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：通过构建的新型隐球菌血流感染大鼠模型,运用本课题前期研究建立的实时荧光定量PCR (real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR)检测体系,对不同时间段新型隐球菌血流感染大鼠的血液、肺泡灌洗液、脑脊液标本分别进行FQ-PCR、血培养、血清荚膜抗原检测,比较各检测方法的敏感性和特异性,为临床应用新型隐球菌FQ-PCR检测提供实验室依据。方法：1.将60只雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠,SPF级,6-8周,体重200±20g,随机分为4组,分别为A组免疫抑制感染组(n=20只),B组正常状态感染组(n：20),C组免疫抑制对照组(n=10),D组正常对照组(n=10)；四组中奇数编号大鼠在0、12、48h,偶数编号大鼠在6、24、72h分别各留取全血2.5ml。A组和C组大鼠实验第一天一次性腹腔注射环磷酰胺(150mg/kg), B组和D组腹腔注射等量1ml生理盐水；实验第4天A组和B组根据预实验的最佳新型隐球菌菌悬液浓度1×10。菌悬液尾静脉注射1ml,C组和B组注射等量的1ml生理盐水。2.在实验第4天大鼠感染模型建立成功后,从大鼠眼内侧静脉丛按奇偶编号分别采集3个时间段的血液标本,离心分离和收集血浆样品,-20℃保存待测。采血时间分别为0、6、12、24、48、72h。实验第6天大鼠全部处死,无菌操作下,收集4组大鼠的肺泡灌洗液、脑脊液,-20℃保存待测；同时取肺、肝、脾、脑组织和用10%的甲醛溶液固定过夜,石蜡切片下常规HE染色、PAS染色,光学显微镜下观察。3.提取大鼠血浆、肺泡灌洗液、脑脊液标本的DNA,用前期建立的荧光定量PCR方法对分别对不同时间段感染的血标本、脑脊液及肺泡灌洗液进行检测,并同时进行培养方法、组织病理、墨汁染色、荚膜凝集实验,比较4种不同方法检测的结果。结果：1.通过环磷酰胺免疫抑制尾静脉注射新型隐球菌感染的大鼠模型,易出现系统性的感染,包括肺、脑、脾、肝组织的感染,不仅解剖肉眼发现,肺脏出现多发性结节样改变,并且各组织病理的PAS染色均发现大量圆形或卵圆形隐球菌体,证实血流感染大鼠建模成功。2.A组血培养结果最高达30%,四组之间阳性率比较,差异无统计学意义(P0.05)。A组荚膜抗原法的阳性率可达(80%),在48小时后检测阳性率高于B、C、D组,差异有统计学意义(P0.05)。3.新型隐球菌FQ-PCR检测体系A组血浆12h后的阳性率与B、C、D组相比较,检测阳性率高,差异有统计学意义(P0.05),且对于血液标本来说,FQ-PCR检测方法的阳性率明显优于血培养及血清荚膜抗原法,而且可以定量,差异有统计学意义(P0.05)。4.新型隐球菌FQ-PCR检测体系可检测出肺泡灌洗液标本中的病原体,高于培养、墨汁染色阳性检出率,差异有统计学意义(P0.05)。5.新型隐球菌FQ-PCR检测体系可检测出脑脊液标本中的病原体,高于墨汁染色阳性检出率,差异有统计学意义(P0.05)。结论：1.通过环磷酰胺免疫抑制尾静脉注射隐球菌菌悬液能成功构建大鼠血流感染动物模型；2.新型隐球菌FQ-PCR反应体系能检测出感染大鼠血液中的病原菌,在72小时内随着感染时间的延长,阳性率逐渐上升,其敏感性高于血培养、血清荚膜抗原检测；3.新型隐球菌FQ-PCR检测方法较血培养及血清荚膜抗原检查更早检测到感染大鼠血液中的病原菌；4.新型FQ-PCR体系能检测到大鼠肺泡灌洗液及脑脊液中病原菌。
【关键词】：实时荧光定量PCR 动物模型 新型隐球菌 检测 鼠
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R-332;R519.4
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 引言12-16
• 1 材料与方法16-24
• 1.1 实验的材料16-17
• 1.2 实验仪器17-18
• 1.3 研究方法18-23
• 1.4 数据统计方法23-24
• 2 结果24-37
• 2.1 血流感染动物模型结果24-29
• 2.2 四种方法检测结果29-37
• 讨论37-42
• 结论42-43
• 参考文献43-50
• 综述50-61
• 参考文献55-61
• 主要英文缩写词表61-62
• 在读期间发表的主要学术论文及参与课题62-63
• 致谢63-64

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本文编号：333866