沙门氏菌FliT-FliD蛋白复合物及大肠杆菌O157:H7 Z0021蛋白结构与功能研究

发布时间：2017-04-29 03:07

  本文关键词：沙门氏菌FliT-FliD蛋白复合物及大肠杆菌O157:H7 Z0021蛋白结构与功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：鞭毛位于细菌的表面,是细菌主要的运动器官。自然界中,通过鞭毛的推动作用细菌能逃离不利的环境,到达营养更丰富、更利于其生存的环境中。有些肠道致病菌在鞭毛的推动作用下,能很快的吸附到上皮细胞表面,进入血液,使宿主致病。因此,越来越多的新型抗菌药物都选择鞭毛的合成途径作为靶点。 细菌鞭毛的合成是一个自组装的过程。它是由一系列的蛋白组成的一个大的蛋白质复合体。与鞭毛合成相关基因的转录翻译都有着严格的调控。按照基因的转录顺序,鞭毛基因被分为三类：第一级、第二级以及第三级鞭毛基因。flhDC操纵子处于整个鞭毛基因转录翻译的最上游,首先被翻译出来。此操纵子翻译出来的FlhD和FlhC两个蛋白能组装成异源蛋白六聚体FlhD4C2。FlhD4C2复合物是一种转录调控因子,能促进第二级鞭毛基因的转录。二级鞭毛基因主要表达基体、钩形鞘蛋白及鞭毛特异性转录因子628。三级鞭毛基因主要负责鞭毛蛋白、一些调控蛋白及一些未知功能蛋白的表达。 鞭毛蛋白的表达和组装过程受不同层次上很多因子的调控。鞭毛基因的调控涉及到DNA水平、mRNA水平及蛋白水平,FlhD4C2复合体是鞭毛合成调控的重要位点。本文的研究对象FliT是在蛋白水平上调控FlhDC功能的蛋白。 FliT是一种鞭毛特异性的分子伴侣,它能特异性地结合FliD,一方面抑制FliD在细胞质中的聚沉,另一方面促进FliD的运输。FliT还可以和FlhDC复合体相互作用,抑制鞭毛基因的表达。本论文的主要研究内容和结论如下： (1)确定FliD与FliT作用的最小区域。为了找到与F1iT相互作用的最小FliD片段,我们克隆了四个FliD片段：FliD1-115aa、FliD1-215aa、FliD115-end、215-end。通过pull down,我们将与FliT作用的区域确定为FliDC端的210个氨基酸残基。 (2)获得FliT与FliD的蛋白复合物晶体。我们共转了FliT94与FliD(215-end),得到含有可同时表达FliD和FliT蛋白的菌株。通过离子交换柱、分子筛纯化蛋白,冰上用胰蛋白酶消化蛋白复合体30min,筛晶体得到了FliT与FliD的蛋白复合物晶体。 (3)确定FliT与FliD、 FlhDC作用的氨基酸。我们克隆了FliT的5个点突变体：F7S、W11S、W30S、Y40S、Y67S。通过pull down,我们发现W30S突变体不能再和FliD结合,由此,我们得知FliT30位的色氨酸参与其与FliD的相互作用。用同样的方法,我们遗憾地发现5个点突变体都还能继续与FlhDC结合。 本课题的另一部分是关于大肠杆菌0157：H7中Z0021蛋白结构和功能的研究。大肠杆菌0157：H7是一种胃肠病原体,能引发人体多种疾病。Z0021基因位于OI-1菌毛编码区,是一种新发现的鞭毛合成抑制因子。敲除Z0021基因后,大肠杆菌0157：H7细菌表面鞭毛数量增加,移动性显著增强。相反,如果过表达Z0021基因,就会抑制细菌移动。通用转录报告系统,发现Z0021蛋白不影响FlhDC的转录翻译,但影响二级三级基因的转录。在Z0021过表达的菌株中,FlhD4C2表达水平也随之上调。我们尝试通过纯化结晶的方法得到Z0021蛋白的结构,并解释其对细菌移动性的抑制机理。SignalP4.1Server预测发现Z0021的前18位氨基酸可能是信号肽。我们构建了Z0021-pGEX和Z0021-23-end-pGEX克隆,通过细菌移动性实验,我们发现Z0021的全长蛋白和片段23-end均能抑制细菌移动性。由此,我们推测Z0021发挥功能的区域可能是细胞质而非周质空间。
【关键词】：鞭毛 FliT FliD ZOO21 细菌移动性
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 符号说明10-11
• 第一章 前言11-23
• 1.1 细菌鞭毛简介11-16
• 1.1.1 鞭毛的合成和组装12-14
• 1.1.2 鞭毛合成的调控14-15
• 1.1.3 鞭毛的运动性和生物膜15
• 1.1.4 鞭毛基因第一级表达产物FlhD4C2复合体的结构与功能研究进展15-16
• 1.2 沙门氏菌FliT、FliD蛋白的介绍16-18
• 1.3 大肠杆菌O157：H7 Z0021蛋白的介绍18-20
• 1.4 晶体结构的解析20-22
• 1.4.1 X射线的产生20
• 1.4.2 X射线衍射原理20-22
• 1.5 本课题的研究内容22-23
• 第二章 stFliD与stFliT94作用最小片段的确定23-31
• 2.1 实验材料和方法23-28
• 2.1.1 实验材料23-24
• 2.1.2 仪器设备24
• 2.1.3 实验方法24-28
• 2.1.3.1 构建表达载体24-27
• 2.1.3.2 构建FliT94和FliD共表达菌株27
• 2.1.3.3 蛋白质过表达与纯化27-28
• 2.2 实验结果28-29
• 2.2.1 stFliDl-116aa、stFliD1-215aa、stFliD215-end的蛋白纯化28
• 2.2.2 确定与stFliT94作用的stFliD最小片段28-29
• 2.3 本章小结29-31
• 第三章 stFliT94-stFliD215-end蛋白复合物的纯化结晶31-41
• 3.1 实验方法与步骤31-32
• 3.1.1 蛋白复合物的纯化结晶31
• 3.1.2 胰蛋白酶酶切条件的摸索31-32
• 3.1.3 胰蛋白酶酶解产物大量纯化实验32
• 3.2 实验结果32-40
• 3.2.1 stFliT94-stFliD(215-end)蛋白纯化结晶32-34
• 3.2.2 stFliT94-stF1iD(215-end)no-tag蛋白复合物纯化结晶34-37
• 3.2.3 stFliT94-stFliD(215-end)胰蛋白酶切蛋白复合物的纯化37-39
• 3.2.4 stFliT94-stFliD(215-end)蛋白复合体结晶条件筛选和晶体优化39-40
• 3.3 本章小结40-41
• 第四章 stFliT与stFliD、stFlhD_4C_2相互作用研究41-49
• 4.1 实验材料及仪器41-42
• 4.1.1 菌株及载体41
• 4.1.2 仪器与试剂41-42
• 4.2 具体实验步骤42-44
• 4.2.1 stFliT突变体的构建及突变体蛋白纯化42-43
• 4.2.2 Pull down实验步骤43-44
• 4.3 实验结果44-48
• 4.3.1 stFliT突变体蛋白纯化44-45
• 4.3.2 stFliT-stFliD pull down实验45-47
• 4.3.3 stFliT-stFlhDC复合物pull down实验47-48
• 4.4 本章小结48-49
• 第五章 大肠杆菌O157：H7 Z0021蛋白结构与功能研究49-61
• 5.1 Z0021蛋白背景介绍49-51
• 5.2 Z0021蛋白基本信息51-52
• 5.3 实验材料和方法52-54
• 5.3.1 菌株及载体52
• 5.3.2 试剂和仪器52
• 5.3.3 基因的克隆52-54
• 5.4 实验结果54-60
• 5.4.1 Z0021蛋白纯化54-59
• 5.4.2 Z0021蛋白对细菌移动性的影响59-60
• 5.5 本章小结60-61
• 全文总结61-63
• 参考文献63-67
• 致谢67-69
• 学位论文评阅及答辩情况表69

【共引文献】

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