人脐血间充质干细胞源性的类许旺细胞与人胎儿坐骨神经许旺细胞差异蛋白组学的研究

发布时间：2017-04-29 06:12

  本文关键词：人脐血间充质干细胞源性的类许旺细胞与人胎儿坐骨神经许旺细胞差异蛋白组学的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景：周围神经损伤缺损的临床治疗是世界难题，自体神经移植是金方法，但会造成供区神经损伤。通过组织工程化的人工神经修复周围神经缺损是当前临床研究的热点。人工神经的种子细胞为SCs(Schwann cells,SCs)，其来源主要有自体SCs、异体SCs、以及由间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）定向诱导分化而来，而MSCs诱导而来的类SCs以其来源广泛，活性强更受学者青睐。人脐血间充质干细胞(Human Umbilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cells,HUCBMSCs)作为最先应用的人骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）的一种替代来源，在体外诱导培养中已证明其具有向SCs分化的能力，但是其生物学行为和正常SCs有哪些异同之处还有待进一步研究。目的：本研究旨在建立人胎儿坐骨神经SCs的分离、培养、纯化及鉴定体系，结合本课题组以往的HUCBMSCs培养及体外诱导经验，将HUCBMSCs、HUCBMSCs体外诱导后的类SCs以及人SCs三种细胞进行蛋白质组学的分析，寻找差异蛋白点。 方法：采用课题组既往HUCBMSCs培养及体外诱导方法获得HUCBMSCs以及类SCs；取药物引产的10具12~16周人胎儿胎坐骨神经，剥离神经外膜、剪碎、消化、离心、培养，待长满瓶底后，分A组采用低酶消化、差速贴壁以及D-Valine条件培养基纯化SCs；B组采用低酶消化结合差速贴壁纯化法纯化；C组采用D-Valine条件培养基纯化法；D组不采用任何纯化处理。根据SCs特有显微镜下形态统计各组细胞纯度，选取纯度最高的一组进行下一步实验。提取这三种细胞的总蛋白，利用双向凝胶电泳分离蛋白并银染，利用ImageMaster软件进行分析对比，选取HUCBMSCs与SCs相比表达低的点和HUCBMSCs诱导过程中增加的蛋白点之间的匹配点进行质谱分析，并选取适当蛋白进行免疫印迹验证。结果：1）采用低酶消化、差速贴壁以及D-Valine条件培养基纯化的SCs的纯度5d后达到99.1%。2）得到分辨率和重复性均较好的双向凝胶电泳图谱，每组胶的蛋白表达点为3500个上下，平均匹配率分别为98%、95%、97%。3）诱导前的HUCBMSCs与SCs有290个蛋白差异点，诱导后的类SCs与SCs仅有161个差异蛋白点，表明诱导后的HUCBMSCs在蛋白质组成方面更加接近SCs。4）对筛选出的41个蛋白匹配点，其中有25个蛋白点差异超过3倍，取这25个蛋白点进行质谱分析最终共有20个点被成功鉴定，分别属于细胞骨架蛋白、细胞调控蛋白、能量代谢蛋白以及蛋白酶类蛋白，其中包含两种公认的SCs标记蛋白（S100β及GFAP）。5）在这20个蛋白点中选取3种蛋白进行免疫印迹验证，验证结果基本与双向电泳及质谱鉴定的结果一致。 结论： 1.通过低酶消化、差速贴壁以及D-Valine条件培养基相结合纯化SCs的方法培养SCs所需时间较短，纯度更高，能够为下一步的神经组织工程提供细胞来源。 2. HUCBMSCs诱导后在蛋白质构成方面更加接近正常的SCs。 3.本实验成功鉴定出的20个蛋白点，分别属于细胞骨架蛋白、细胞调控蛋白、能量代谢蛋白以及蛋白酶类蛋白，这些蛋白的含量变化是由于诱导剂刺激细胞产生的，，大多数对于神经的分化与生长起着重要的作用，这其中还包含两种公认的SCs标记蛋白（S100β及GFAP）。 4.这些差异蛋白的寻找对于今后更好的优化体外诱导方案以及指导间充质干细胞的体外的定向诱导提供可靠的依据。
【关键词】：脐血 间充质干细胞 分化 SCs 双向电泳 质谱分析
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R321
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 引言9-11
• 第一部分 人脐血间充质干细胞的分离培养、扩增、鉴定及体外诱导11-24
• 1. 材料与方法11-18
• 2. 结果18-22
• 3. 讨论22-24
• 第二部分 流产胎儿坐骨神经许旺细胞的体外培养与纯化24-34
• 1. 主要仪器、试剂与方法24-28
• 2. 结果28-31
• 3. 讨论31-34
• 第三部分 间充质干细胞、类许旺细胞与许旺细胞蛋白组学比较34-60
• 1. 材料、器材与试剂34-38
• 2. 操作步骤38-46
• 3. 结果46-55
• 4. 讨论55-60
• 结论60-61
• 参考文献61-65
• 致谢65-66
• 附录66-75
• 附录A 英中文术语和缩略语对照表66
• 附录B 个人简历66-67
• 附录C 已发表论文67
• 附录D 综述67-75
• 参考文献73-75

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：334350