RAN干扰小鼠间充质干细胞系C3H10 T1/2中B7-H4表达的体外实验研究
发布时间：2021-08-15 05:18
目的筛选有效的siRNA序列,研究靶向负性协同刺激分子B7-H4的特异性小干扰RNA（siRNA）对小鼠间充质干细胞株C3H10 T1/2（C3H10）中B7-H4表达的抑制作用,探讨C3H10细胞中B7-H4的免疫抑制作用及对小鼠淋巴细胞活化诱导细胞死亡（AIDC）的影响。方法应用细胞免疫荧光、RT-PCR及Western blot等方法检测C3H10细胞中B7-H4的表达情况;设计并合成三对针对小鼠B7-H4基因的特异性siRNA和绿色荧光素标记的FAM-siRNA阴性对照序列,脂质体转染法将siRNA转染入C3H10细胞;通过荧光显微镜及流式细胞仪（FCM）检测表达绿色荧光素的C3H10细胞评估siRNA的转染效率;利用RT-PCR和Western blot的方法测定不同序列的特异性siRNA干预C3H10细胞后B7-H4的mRNA及蛋白表达水平,筛选出具有最大抑制作用的siRNA为最佳序列;利用RT-PCR确定最佳转染浓度;B7-H4靶向siRNA干预C3H10后,与小鼠的脾脏淋巴细胞共培养,用FCM行淋巴细胞计数及检测淋巴细胞周期和凋亡。结果荧光显微镜及激光共聚焦显微镜观察发...
【文章来源】：苏州大学江苏省 211工程院校
【文章页数】：56 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
免疫荧光检测B7-H4蛋白在C3H10细胞中的表达情况，倒置显微镜观察拍照(×200)
DAPI 染色法染细胞核，我们可以清晰的看到细胞质内的绿色荧光（图 2a-A），同一视野下细胞核呈现蓝色（图2a-B），叠加处理两张图片（图 2a-C）可见转染效率可达到 80%。流式细胞仪检测 siRNA-FAM 10nM、20nM 和 50nM 转染效率，经 WinMDI 2.9软件分析，M2 的数值代表阳性转染率，显示转染 siRNA-FAM 10nM、20nM 和 50nM转染效率分别为 72.43%、78.65%和 86.43%（图 2b）。图 2a siRNA-FAM 50nM 转染 C3H10 细胞倒置显微镜观察转染效率，并拍照(×100)。（A）：A 暗场下 siRNA-FAM（绿色）；（B）：DAPI 染色法染细胞核（蓝色）；（C）：（A）和（B）两者叠加；（D）：同一视野下明场拍照。3.siRNA 下调 C3H10 中 B7-H4 的表达3.1 western blot 检测转染的 C3H10 细胞下调 B7-H4 蛋白表达转染各组 siRNA-B7-H4 50nM，72h 后收集细胞，Western blot 检测 B7-H4 蛋白的
设空白对照(Blank)和 siRNA 阴性对照（siRNA-N.C.）,选 GAPDH 作为内参。由图 3.1 可以看到，与对照组相比，转染 siRNA-1 后 B7-H4 蛋白表达量明显下降。图2b 不同浓度siRNA-FAM转染C3H10细胞流式细胞仪检测转染效率。（A）:未转染 siRNA-FAM 的空白对照；（B）:转染 siRNA-FAM 10nM；（C）:转染siRNA-FAM 20nM；（D）:转染 siRNA-FAM 50 nM。图 3.1 50nM 各组 siRNA 转染 C3H10 细胞 Western blot 检测 B7-H4 蛋白分子表达情况。Blank：空白对照；N.C.：转染阴性对照 siRNA；siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3：分别为转染干扰目的分子 B7-H4 的三对不同位点的 siRNA。3.2 RT-PCR 检测 siRNA 转染 C3H10 细胞 B7-H4 表达下调转染各组 siRNA-B7-H4 50nM，72h 后收集细胞，抽提细胞中的 RNA，逆转录cDNA，RT-PCR 检测 C3H10 细胞 B7-H4 mRNA 的表达情况。设空白对照(Blank)和
【参考文献】：
期刊论文
[1]Recombinant human B7-H4 expressed in Escherichia coli inhibits T lym-phocyte proliferation and IL-2 secretion in vitro[J]. Yi-xiang MAO~(2,3)Yong-Jing CHEN~2 Yan GE~2 Hong-bing MA~2 Jian-feng YU~2 Hong-ya WU~2 Yu-min HU~2 Qin WANG~2 Qin SHI~2 Xue-guang ZHANG~(2,4)2 Institute of Biotechnology,Soochow University,Suzhou 215007,China;3 Department of Oncology,First Affiliated Hospital to Soochow University,Suzhou 215007,China. Acta Pharmacologica Sinica. 2006(06)
本文编号：3343932
【文章来源】：苏州大学江苏省 211工程院校
【文章页数】：56 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
免疫荧光检测B7-H4蛋白在C3H10细胞中的表达情况，倒置显微镜观察拍照(×200)
DAPI 染色法染细胞核，我们可以清晰的看到细胞质内的绿色荧光（图 2a-A），同一视野下细胞核呈现蓝色（图2a-B），叠加处理两张图片（图 2a-C）可见转染效率可达到 80%。流式细胞仪检测 siRNA-FAM 10nM、20nM 和 50nM 转染效率，经 WinMDI 2.9软件分析，M2 的数值代表阳性转染率，显示转染 siRNA-FAM 10nM、20nM 和 50nM转染效率分别为 72.43%、78.65%和 86.43%（图 2b）。图 2a siRNA-FAM 50nM 转染 C3H10 细胞倒置显微镜观察转染效率，并拍照(×100)。（A）：A 暗场下 siRNA-FAM（绿色）；（B）：DAPI 染色法染细胞核（蓝色）；（C）：（A）和（B）两者叠加；（D）：同一视野下明场拍照。3.siRNA 下调 C3H10 中 B7-H4 的表达3.1 western blot 检测转染的 C3H10 细胞下调 B7-H4 蛋白表达转染各组 siRNA-B7-H4 50nM，72h 后收集细胞，Western blot 检测 B7-H4 蛋白的
设空白对照(Blank)和 siRNA 阴性对照（siRNA-N.C.）,选 GAPDH 作为内参。由图 3.1 可以看到，与对照组相比，转染 siRNA-1 后 B7-H4 蛋白表达量明显下降。图2b 不同浓度siRNA-FAM转染C3H10细胞流式细胞仪检测转染效率。（A）:未转染 siRNA-FAM 的空白对照；（B）:转染 siRNA-FAM 10nM；（C）:转染siRNA-FAM 20nM；（D）:转染 siRNA-FAM 50 nM。图 3.1 50nM 各组 siRNA 转染 C3H10 细胞 Western blot 检测 B7-H4 蛋白分子表达情况。Blank：空白对照；N.C.：转染阴性对照 siRNA；siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3：分别为转染干扰目的分子 B7-H4 的三对不同位点的 siRNA。3.2 RT-PCR 检测 siRNA 转染 C3H10 细胞 B7-H4 表达下调转染各组 siRNA-B7-H4 50nM，72h 后收集细胞，抽提细胞中的 RNA，逆转录cDNA，RT-PCR 检测 C3H10 细胞 B7-H4 mRNA 的表达情况。设空白对照(Blank)和
【参考文献】：
期刊论文
[1]Recombinant human B7-H4 expressed in Escherichia coli inhibits T lym-phocyte proliferation and IL-2 secretion in vitro[J]. Yi-xiang MAO~(2,3)Yong-Jing CHEN~2 Yan GE~2 Hong-bing MA~2 Jian-feng YU~2 Hong-ya WU~2 Yu-min HU~2 Qin WANG~2 Qin SHI~2 Xue-guang ZHANG~(2,4)2 Institute of Biotechnology,Soochow University,Suzhou 215007,China;3 Department of Oncology,First Affiliated Hospital to Soochow University,Suzhou 215007,China. Acta Pharmacologica Sinica. 2006(06)
本文编号：3343932
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