hTERT基因转染大鼠雪旺细胞的实验研究

发布时间：2017-04-29 14:09

  本文关键词：hTERT基因转染大鼠雪旺细胞的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：雪旺细胞作为周围神经工程中的核心种子细胞，在神经修复。再生等方面发挥重要作用，而体外培养的雪旺细胞，常因多次连续传代后衰老而凋亡，最终死亡。永生化雪旺细胞具有无限传代的功能，可解决雪旺细胞在组织工程中应用的难题。本实验通过hTERT基因转染大鼠雪旺细胞以期得到永生化细胞。 方法：1.选取出生后7天左右的SD大鼠，冰冻处死后酒精浸泡消毒，取其坐骨神经以及臂丛神经，剪碎至1mm3大小的组织块，，双酶消化法进行体外分离培养，待细胞生长到85%汇合密度时用低浓度胰酶快速消化传代，30分钟差速贴壁法进一步纯化雪旺细胞，用光学显微镜进行形态学观察并拍照。经S100免疫荧光鉴是否为雪旺细胞。2.将纯化的雪旺细胞用含hTERT基因的质粒经脂质体转染法转染原代雪旺细胞，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，待细胞生长满80%密度时更换含G418（100ug/ml）的完全培养基，每3天换液1次，筛选2周，转入含hTERT基因的质粒的细胞经过筛选获得阳性克隆后继续传代培养，传代后的细胞经S-100蛋白免疫荧光鉴定。3.转染成功后的雪旺细胞进行传代培养，取转染后第5、10、20、30代雪旺细胞与原代雪旺细胞及未转染培养5代的雪旺细胞进行实验，应用荧光定量PCR和免疫印迹Western bloting法分别检测雪旺细中NGF、BDNF和BFGF的表达情况。 结果：1.经双酶消化法可以获得大量处于增殖状态的雪旺细胞，应用差速贴壁传代法后可以获得典型的长梭形放射状肩并肩排列的雪旺细胞，光镜视野下雪旺细胞纯度可以达到90%以上，成纤维细胞量少，经S-100蛋白免疫荧光测定鉴定为雪旺细胞。2. hTERT基因转染雪旺细胞后光学显微镜观察可见转染后的雪旺细胞胞体体积大，呈长梭形，无规则贴壁生长，荧光显微镜下观察见未转染的细胞无荧光，转染成功的细胞为绿色荧光。经S100免疫荧光鉴定为雪旺细胞。3.通过荧光定量PCR实验发现，原代雪旺细胞中NGF mRNA的表达较培养五代的雪旺细胞明显增加，hTERT基因转染后的雪旺细胞中NGF mRNA的表达呈现稳定性，并且随着传代次数的增加，其表达逐渐降低。BDNF和BFGF mRNA表达也具有相同的情况，培养五代的雪旺细胞中BDNF和BFGF mRNA表达明显降低，而转染初期（转染后5、10代）其表达能力维持在稳定水平，但随着传代次数的增加，其表达能力逐渐下降。上述结果具有统计学意义（P0.05）。4. Western Bloting结果分析显示，培养五代的雪旺细胞中NGF蛋白表达较原代雪旺细胞明显减少，具有统计学意义（P0.05），转染后的雪旺细胞NGF蛋白表达与原代雪旺细胞大致相同，且均高于培养五代的雪旺细胞，可见NGF细胞在转染后早期（转染后5、10代）与晚期（转染后20、30代）均能稳定表达，无明显差异（P0.05）。BDNF和BFGF蛋白表达情况基本一致，原代雪旺细胞与转染早期（转染后5、10代）的雪旺细胞中两个蛋白的表达情况基本相同，并且均高于培养5代的雪旺细胞和转染后晚期（转染后20、30代）的雪旺细胞，结果具有统计学意义（P0.05）。 结论：1.选用7天左右的SD乳鼠作为取材的对象，其雪旺细胞的活力较好，可以获取大量的一段时期内增殖较快并且纯化率较高的雪旺细胞。2.应用脂质体转染法可以成功的将含hTERT的质粒转染入雪旺细胞。并且该方法的得到的雪旺细胞能维持原有的形态，无肿瘤化倾向，并且具有良好的分泌功能。3.转染成功后的雪旺细胞其增值能力增强，分泌NGF、BDNF、BFGF的能力也随之增强，可以解决正常培养的雪旺细胞增能力有限和分泌不足的问题。
【关键词】：hTERT 转染 雪旺细胞
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 前言11-12
• 材料与方法12-22
• 1.实验材料12-14
• 1.1 组织来源12
• 1.2 主要药品与试剂12-13
• 1.3 主要仪器13-14
• 2.实验方法14-22
• 2.1 雪旺细胞的原代分离培养14-15
• 2.2 脂质体法 hTERT 转染雪旺细胞15
• 2.3 实验分组15
• 2.4 免疫荧光15-16
• 2.5 荧光定量 PCR16-19
• 2.6 Western Blot19-22
• 2.7 统计学分析22
• 结果22-25
• 1.原代雪旺细胞的形态学观察及鉴定22-23
• 2.hTERT 基因转染后的雪旺细胞23
• 3.免疫荧光鉴定转染后雪旺细胞23-24
• 4. 荧光定量 PCR 检测转染后雪旺细胞分泌蛋白 mRNA24-25
• 5. Western Bloting 检测转染后雪旺细胞分泌蛋白的表达25
• 讨论25-29
• 结论29-30
• 参考文献30-32
• 综述32-43
• 参考文献39-43
• 致谢43-44

【参考文献】

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本文编号：335025