Pim-2基因对缺氧复氧条件下H9c2细胞凋亡的影响

发布时间：2017-04-29 19:10

  本文关键词：Pim-2基因对缺氧复氧条件下H9c2细胞凋亡的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 通过建立H9c2大鼠心肌样细胞缺氧复氧模型（A/R），采用Western Blot技术来检测Pim-2蛋白在不同缺氧复氧时间点的表达及其变化规律。通过构建PCMV-Pim-2-Flag质粒转染H9c2细胞来过表达Pim-2基因，探讨其对缺氧复氧条件下H9c2细胞凋亡的影响。 方法： H9c2大鼠心肌样细胞购于上海中科院细胞库，用含有10%灭活的胎牛血清、含有工作浓度分别为100U/ml，0.1mg/ml青霉素、链霉素的高糖DMEM培养基于37℃、饱和湿度的5%CO2培养箱中培养，隔天更换培养基，细胞生长融合率达到90%左右时开始进行实验。 1配置缺氧液，利用缺氧液和缺氧复氧装置，建立H9c2细胞缺氧复氧模型，分别取2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h为缺氧培养时间点，以常规培养的H9c2心肌细胞作为对照，Western Blot检测Pim-2蛋白的表达。取Pim-2蛋白表达的峰值时间为缺氧时间点。取0h、2h、4h、8h、10h为复氧培养时间点，Western Blot检测Pim-2蛋白的表达，此时Pim-2表达的高峰时间点即为本实验缺氧复氧的时间点。 2将本实验室已成功构建的PCMV-Pim-2-Flag和PCMV-flag质粒转染H9c2心肌细胞。实验分组：○1空白对照组；○2缺氧复氧组：步骤1所选择出的缺氧复氧时间点；○3PCMV-Pim-2-Flag+缺氧复氧组；○4PCMV-Pim-2-Flag组；○5PCMV-Flag+缺氧复氧组；○6PCMV-Flag组。用流式细胞仪检测H9c2心肌细胞凋亡，Western Blot、PCR分别检测Pim-2mRNA水平及蛋白水平的表达情况。 结果： 1.Pim-2基因转染对H9c2心肌细胞A/R损伤后凋亡的影响 与正常组相比，A/R组的细胞凋亡率明显增高（5.103±0.136%vs22.81±0.425%，P＜0.05）。与A/R组及PCMV-Flag+A/R组相比，过表达Pim-2基因+A/R组即PCMV-Pim-2-Flag+A/R组的细胞凋亡率明显降低（22.81±0.425%vs14.55±0.021%，P＜0.05；23.267±0.41%vs14.55±0.021%，P＜0.05）。与正常组相比，PCMV-Pim-2-Flag组和PCMV-Flag组的细胞凋亡率无明显差别（5.103±0.136%vs5.25±0.59%，P＞0.05；5.103±0.136%vs5.45±0.15%，，P＞0.05）结果显示过表达Pim-2基因能抵抗缺氧复氧条件下诱导的H9c2细胞凋亡。 2.A/R条件对H9c2细胞Pim-2mRNA表达的影响 与正常组相比，A/R组的Pim-2mRNA的表达明显升高（0.399±0.110vs0.441±0.014，P＜0.05）。与PCMV-Pim-2-Flag组、A/R组和PCMV-Flag+A/R比，过表达Pim-2基因+A/R组即PCMV-Pim-2-Flag+A/R组的mRNA表达增加（0.541±0.015vs0.694±0.018，P＜0.05；0.441±0.014vs0.694±0.018，P＜0.05；0.456±0.010vs0.694±0.018，P＜0.05）。与正常组相比，PCMV-Flag组Pim-2mRNA表达无明显差别（0.399±0.110vs0.389±0.010，P＞0.05）。证明A/R能诱导Pim-2mRNA表达的增加，转染后Pim-2mRNA获得了高水平表达。 3.A/R条件对H9c2细胞Pim-2蛋白表达的影响 H9c2心肌细胞经A/R干预后，各缺氧复氧组Pim-2蛋白的表达较正常对照组明显升高且具有统计学差异，取Pim-2蛋白的表达的峰值时间点缺氧12h/2h作为缺氧复氧干预条件（1.672±0.065vs1.514±0.067，P＜0.05）。转染Pim-2重组载体后，实验分6组进行。与正常组相比，A/R组的Pim-2蛋白的表达明显升高（1.514±0.067vs1.636±0.029，P＜0.05）。与PCMV-Pim-2-Flag组、A/R组和PCMV-Flag+A/R比，过表达Pim-2基因+A/R组即PCMV-Pim-2-Flag+A/R组的蛋白表达增加（1.784±0.062vs1.930±0.065，P＜0.05；1.636±0.029vs1.930±0.065，P＜0.05；1.659±0.033vs1.930±0.065，P＜0.05）。与正常组相比，PCMV-Flag组Pim-2蛋白表达无明显差别（1.514±0.067vs1.517±0.052，P＞0.05）。证明A/R能诱导Pim-2蛋白表达的增加，转染后Pim-2蛋白获得了高水平表达。 结论： A/R能诱导H9c2大鼠心肌样细胞凋亡，正常条件下Pim-2基因呈低表达状态，A/R能增加Pim-2基因的表达，以缺氧12h复氧2h最为明显。过表达Pim-2基因能抵抗缺氧复氧条件下诱导的H9c2细胞凋亡。
【关键词】：Pim-2基因 H9c2心肌细 缺氧复氧损伤 细胞凋亡
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-11
• 中英文缩略词表11-12
• 第1章 引言12-14
• 第2章 材料与方法14-27
• 2.1 材料14-18
• 2.1.1 实验细胞及质粒14
• 2.1.2 主要试剂14-15
• 2.1.3 自配试剂15-18
• 2.1.4 主要设备18
• 2.2 方法18-27
• 2.2.1 H9c2 大鼠心肌样细胞的培养18-20
• 2.2.2 H9c2 心肌细胞缺氧复氧模型的建立20
• 2.2.3 基因转染20-21
• 2.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡21-22
• 2.2.5 PCR 检测22-24
• 2.2.6 Western Blot 检测24-26
• 2.2.7 统计学分析26-27
• 第3章 结果27-34
• 3.1 A/R 条件对 H9c2 细胞 Pim-2 蛋白表达的影响27-30
• 3.2 Pim-2 基因转染对 H9c2 细胞 A/R 损伤后凋亡的影响30-32
• 3.3 A/R 条件对 H9c2 细胞 Pim-2 mRNA 表达的影响32-34
• 第4章 讨论34-38
• 4.1 心肌细胞的凋亡在缺血再灌注损伤中的作用34-35
• 4.2 Pim 家族的结构功能35-36
• 4.3 Pim-2 基因在 H9c2 心肌细胞凋亡过程的作用36-38
• 第5章 结论38-39
• 致谢39-40
• 参考文献40-43
• 综述43-47
• 参考文献46-47

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 李小燕;朱水山;刘亮明;黄缘;;pim-3基因的分子生物学特性及作用[J];医学分子生物学杂志;2008年02期

2 李龙标;陆培荣;张学光;;丝/酪氨酸蛋白激酶PIM3在小鼠眼部组织的表达及分布[J];苏州大学学报(医学版);2006年05期

3 刘亮明;邓欢;张吉翔;罗杰;孙水林;尹东;;丝/苏氨酸激酶Pim-3基因对急性肝功能衰竭肝保护效应的实验研究[J];中华消化杂志;2006年09期

4 丁钢,沈景霞,黄永麟;心肌缺血再灌注损伤中一氧化氮与中性粒细胞之间的关系[J];心血管病学进展;2000年05期

  本文关键词：Pim-2基因对缺氧复氧条件下H9c2细胞凋亡的影响，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：335437