JMJD5相互作用蛋白的鉴定和N端功能的研究

发布时间：2017-04-30 02:15

  本文关键词：JMJD5相互作用蛋白的鉴定和N端功能的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：JMJD5(又称KDM8)是JmjC结构域蛋白家族的一员。最新研究表明它可能在细胞周期调节、胚胎发育、破骨细胞分化以及生物钟节律调节中都有重要作用。JMJD5被报道具有去甲基酶及羟基化酶的功能,但目前关于其作用底物及调控机制的研究还十分有限。同时,JMJD5的JmjC结构域位于C末端(270-416),仅占全长的1/3,而其N端(占全长的2/3)大片区域的结构和功能仍然未知。为深入研究JMJD5的生物学功能,我们首先运用免疫共沉淀(Co-IP)联合质谱的检测方法成功鉴定了38个与JMJD5有相互作用的蛋白,功能涉及细胞信号转导、RNA加工、DNA复制、细胞周期调控、转录调控、凋亡等多个方面,说明JMJD5可能参与了更广泛的细胞内分子事件。在这些相互作用蛋白中,我们还发现了核转运相关分子Importin β和transportin-1。进一步研究表明JMJD5的N端含有经典的核定位信号(NLS)(152-170),可被Importin α/β核转运系统识别,其N端的134-152区域又能与核转运蛋白transportin-1相互作用,两者共同介导了JMJD5在细胞内的核定位过程。而JMJD5的核定位功能更被发现是其能促进Cyclin Al表达的必要条件。此外,我们还发现JMJD5的N端含有一个出核信号(NES)(34-38),受转运蛋白CRM-1的调节介导其出核。在对JMJD5相互作用蛋白的研究中,我们还发现JMJD5可与抑癌蛋白p53发生直接的相互作用。深入研究表明JMJD5的N端可与p53的DNA结合结构域(DBD结构域)相互作用,抑制p53的转录活性,进而抑制p53靶基因DKN1A等的转录激活。在DNA损伤时,JMJD5与p53的相互作用减弱,与染色质的结合也明显减弱,提示JMJD5在DNA损伤反应中可能扮演重要角色。本研究对JMJD5的相互作用蛋白及其N端功能进行了深入解析,将为我们全面理解JMJD5在细胞内的功能及调控机制提供重要线索和依据。
【关键词】：JMJD5 核定位 p53 DNA损伤
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 缩略语9-12
• 1 引言12-16
• 2 实验材料与方法16-30
• 2.1 实验材料16-20
• 2.1.1 细胞系16
• 2.1.2 细胞培养试剂16
• 2.1.3 细胞转染试剂16
• 2.1.4 细胞处理化学物16
• 2.1.5 细胞蛋白提取相关试剂16-17
• 2.1.6 Western blot相关试剂17
• 2.1.7 抗体17-18
• 2.1.8 融合蛋白纯化试剂18
• 2.1.9 分子克隆及荧光定量PCR试剂18
• 2.1.10 SiRNA及PCR引物18-20
• 2.1.11 软件和数据库20
• 2.2 实验方法20-30
• 2.2.1 细胞培养、细胞转染、SiRNA干扰、Adr、LBM、MN-NG处理细胞20-21
• 2.2.2 酸抽提法提取组蛋白21
• 2.2.3 提取细胞核小体21
• 2.2.4 ANTI-FLAG M2 Magnetic Beads免疫共沉淀、抗体免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)21-22
• 2.2.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)22-24
• 2.2.6 原核蛋白表达纯化24-26
• 2.2.7 体外去甲基反应26
• 2.2.8 免疫荧光26-27
• 2.2.9 定点突变27-28
• 2.2.10 PCR28-29
• 2.2.11 染色质免疫共沉淀(CHIP)29
• 2.2.12 染色质结合与分离组份蛋白的提取29-30
• 3 结果30-53
• 3.1 JMJD5相互作用蛋白的质谱鉴定30-33
• 3.2 JMJD5细胞内核定位机制的研究33-43
• 3.2.1 JMJD5核定位的过程依赖于Importin α/β和Transportin-1通路33-35
• 3.2.2 Importin α和Transportin-1作用于JMJD5的不同区域35-36
• 3.2.3 免疫荧光实验进一步明确核定位序列(NLS)的位置及功能36-38
• 3.2.4 JMJD5核定位信号(NLS)上关键氨基酸位点的鉴定38-40
• 3.2.5 JMJD5的N端存在出核信号(NES)40-41
• 3.2.6 核定位功能是JMJD5调控cyclinA1表达所必需的41-43
• 3.3 JMJD5与p53的相互作用及在DNA损伤反应中的功能研究43-53
• 3.3.1 JMJD5与p53相互作用及关键结合区域的鉴定43-46
• 3.3.2 JMJD5与p53相互作用在DNA损伤后减弱46-48
• 3.3.3 siRNA干扰JMJD5表达使得p53的靶基因表达上调48-50
• 3.3.4 JMJD5可抑制p53对靶基因CDKN1A的转录激活50-53
• 4 讨论53-57
• 5 结论和展望57-59
• 5.1 主要结论57
• 5.2 展望57-59
• 参考文献59-63
• 综述63-84
• 参考文献73-84
• 作者简历及在学期间取得的科研成果84

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 Jeffrey Hannah;Peng-Bo Zhou;;The CUL4A ubiquitin ligase is a potential therapeutic target in skin cancer and other malignancies[J];Chinese Journal of Cancer;2013年09期

2 Danila Coradini;Saro Oriana;;The role of maintenance proteins in the preservation of epithelial cell identity during mammary gland remodeling and breast cancer initiation[J];Chinese Journal of Cancer;2014年02期

3 纳小凡;姬明飞;岳岩磊;;DNA双链断裂处染色质重组机制[J];贵州农业科学;2013年12期

4 BA ZhaoQing;QI YiJun;;Small RNAs:Emerging key players in DNA double-strand break repair[J];Science China(Life Sciences);2013年10期

5 濮晓红;叶庆;;TP53基因在特定血液病和淋巴瘤中的研究进展[J];临床肿瘤学杂志;2014年02期

6 胡松林;贺轶博;赵亚丽;雷鸣;杨芬;;组蛋白甲基转移酶EZH2抑制p53活性[J];航天医学与医学工程;2013年06期

7 李进;贺菁菁;林戈;卢光t;;不同人胚胎干细胞系向限定性内胚层分化能力存在差异[J];激光生物学报;2013年06期

8 董伟杰;戈杰;张平;傅瑜;江宏兵;;组蛋白去甲基化酶JMJD3对骨髓基质干细胞干性特征及体外成骨分化的影响[J];口腔生物医学;2014年01期

9 陈斯;王建;杨晓明;;蛋白质相互作用调控蛋白质核转运及其功能[J];生命科学;2008年05期

10 李竹石;许彩民;;通过核质转运调节细胞凋亡的蛋白质[J];中国生物化学与分子生物学报;2009年10期

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1 周芳;黄鳝AR基因的克隆、表达及其蛋白的核质穿梭[D];武汉大学;2010年

2 王立洪;肿瘤标志物中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）与钙调磷酸酶B同源蛋白2（CHP2）的生物学功能研究[D];北京协和医学院;2011年

3 李竹石;亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡过程中MnSOD上调机制的研究[D];中国协和医科大学;2010年

4 辛琪;瑞氏木霉纤维素酶基因转录因子功能及染色质修饰在酶基因转录调控中的作用研究[D];山东大学;2013年

5 贾园荟;组蛋白去甲基化酶PHF8参与神经分化的研究与UHRF1、UHRF2调控起始性DNA甲基化的功能研究[D];华东师范大学;2013年

6 黄星;凋亡抑制蛋白XIAP抑制自噬促进肿瘤形成的作用机制研究[D];中国科学技术大学;2013年

7 王兵;生物芯片和纳米中药对肝胆肿瘤早期诊治的研究[D];华中科技大学;2013年

8 卢一鸣;基于统计建模方法研究真核生物基因表达调控系统[D];中国人民解放军军事医学科学院;2013年

9 郑巍薇;EDAG对人原代CD34~+细胞增殖分化特性影响的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2013年

10 张巍;人体内2种表观遗传修饰识别蛋白和2种支架蛋白的结构研究[D];华中师范大学;2013年

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1 陈春峰;水稻phyA基因转化拟南芥的功能研究[D];华南理工大学;2011年

2 陈斯;核转运受体蛋白质KPNA2与转录因子c-Jun相互作用及其生物学意义初探[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年

3 王健;Ndrg2在细胞内的表达及定位研究[D];第四军医大学;2009年

4 李超;农杆菌介导的豌豆花瓣瞬间表达系统的建立及利用该系统对百脉根TCP基因亚细胞定位的研究[D];上海交通大学;2009年

5 秀花;组蛋白修饰在两细胞系上的分布分析[D];内蒙古大学;2013年

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7 刘坤;小鼠部分重编程细胞系的建立及其可塑性研究[D];内蒙古大学;2013年

8 张玉娟;沉默DOT1L基因对急性单核细胞白血病细胞THP-1增殖的影响[D];北京协和医学院;2013年

9 田尧;基于小波变换表观基因组分析方法的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2013年

10 程敏;沉默Piwil2增强子宫颈癌细胞对顺铂敏感性的机制研究[D];安徽医科大学;2013年

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本文编号：336061