基因工程法构建乳糖酶高产菌株及发酵条件优化的研究

发布时间：2017-04-30 04:11

  本文关键词：基因工程法构建乳糖酶高产菌株及发酵条件优化的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：乳糖酶又称β-半乳糖苷酶,可以催化水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖,并具有半乳糖苷的转移作用。乳糖酶作为一种生物酶制剂,主要用来治疗乳糖不耐受症,处理加工乳制品等,在医药、食品等诸多领域应用十分广泛。但目前乳糖酶的工业化生产还存在许多问题,如：乳糖酶的单位产量较低；多为胞内酶,纯化工艺复杂,应用成本高；适用范围较窄,对环境要求高等。其中米曲霉乳糖酶因其酶学性质好、可胞外分泌、商业化应用多、表达水平低等特点,被本文选为研究对象。 本研究首次将米曲霉(Aspergillus oryzae)乳糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体中,实现该乳糖酶的有效分泌和高效表达。以米曲霉cDNA文库为模板,通过PCR扩增得到米曲霉乳糖酶基因cDNA,序列长度为3015bp。根据毕赤酵母的密码子偏好性对该乳糖酶基因进行了优化,成功提高了其密码子的使用频率,去除了不利于转录和表达的稀有密码子。然后连入GAP系列的表达载体构建基因工程菌株,该系列载体所用的GAP启动子作为组成型启动子,不需要其他毕赤酵母工程菌中常用的甲醇诱导步骤,在食品安全上有效避免了因甲醇使用所带来的问题。经过蓝白斑初筛及活性测定复筛最终得到了一株高产乳糖酶基因工程菌株GalC131。该菌株可高效地将乳糖酶蛋白分泌到胞外,无需破碎细胞,杂蛋白很少,后续纯化工艺简单,经超滤和凝胶层析后,可直接用于牛奶中乳糖水解。 本研究对毕赤酵母工程菌GalC131发酵培养基中的碳源、氮源、金属离子和pH、温度、接种量等发酵条件分别进行了单因素优化,优化后的发酵培养基为葡萄糖45g/L、甘油15g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物20g/L、MgSO4·7H2O9g/L、FeSO4·7H2O60mg/L、CuSO4·5H2O6mg/L、K2HPO44g/L、CaSO40.93g/L、 K2SO418.2g/L、微量元素液1mL/L,发酵条件为pH7、30℃、接种量6%,300r/min。摇瓶发酵产酶酶活可达到672U/mL,较优化前提高了30.7%。在1L发酵罐中对碳源流加速率进行了优化,采用15mL/h-L在发酵16h后开始流加,并将发酵工艺在50L发酵罐中成功进行了中试放大,乳糖酶酶活达到4312U/mL,大大高于目前国内外报道的乳糖酶产量。 本研究对GalCl31所产的重组米曲霉乳糖酶进行酶学性质研究,并以原始米曲霉乳糖酶作为对照。重组酶的最适pH为5.2,并在pH4.6-8.0之间保持稳定；最适反应温度60℃,热稳定性、金属离子稳定性等都优于对照酶,酶学性质表现更好。 本研究还通过HPLC检测该乳糖酶在不同条件下对牛奶中乳糖的水解率,初步研究了其在制备低乳糖牛奶中的使用条件。在37℃、3000U/mL酶液0.3%的添加量条件下,乳糖水解率能达94%以上。同时该乳糖酶在低温条件下也具有良好的乳糖水解率,10℃(0.9%)水解率可达83%以上,25℃(0.9%)可达93%以上,有利于在乳制品生产中避免微生物腐败,保持牛奶新鲜度,降低生产成本。 综上所述,本研究通过基因工程方法成功开发了一种产量高、可胞外分泌、后续纯化简单、生产过程安全、酶学性质好、低温表现良好的新型乳糖酶,为乳糖酶在食品等工业上的进一步大规模应用奠定基础。
【关键词】：乳糖酶 米曲霉 毕赤酵母 pGAPZα载体 基因工程 发酵优化 低乳糖牛奶
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3411
【目录】：

• CATALOG7-10
• 摘要10-12
• ABSTRACT12-14
• 主要符号说明14-15
• 第一章 研究背景15-27
• 1.1 乳糖酶的结构与作用机制15-16
• 1.2 不同来源乳糖酶的酶学性质16-19
• 1.2.1 细菌来源的乳糖酶18
• 1.2.2 酵母菌来源的乳糖酶18
• 1.2.3 霉菌来源的乳糖酶18-19
• 1.3 产乳糖酶微生物的改造19-20
• 1.4 乳糖酶的应用20-22
• 1.4.1 治疗乳糖不耐症20
• 1.4.2 提高乳制品质量20
• 1.4.3 应用于发酵乳制品20-21
• 1.4.4 应用于乳清的处理与综合应用21
• 1.4.5 应用于生产低聚半乳糖21
• 1.4.6 在分子生物学中的应用21-22
• 1.5 斯德毕赤酵母表达系统22-26
• 1.5.1 毕赤酵母表达系统的优点22
• 1.5.2 常用毕赤酵母宿主菌22-23
• 1.5.3 常用毕赤酵母表达载体和元件23-24
• 1.5.4 影响毕赤酵母表达外源蛋白的因素24-26
• 1.6 本研究的目的和意义26-27
• 第二章 米曲霉乳糖酶的克隆及在毕赤酵母中的高效表达27-46
• 2.1 材料27-28
• 2.1.1 菌株与载体27
• 2.1.2 试剂27
• 2.1.3 培养基27-28
• 2.1.4 仪器28
• 2.2 方法28-37
• 2.2.1 米曲霉乳糖酶基因的提取28-32
• 2.2.2 米曲霉乳糖酶基因序列的分析与优化32
• 2.2.3 乳糖酶基因在毕赤酵母中的表达32-35
• 2.2.4 乳糖酶活性的测定35-37
• 2.3 结果与讨论37-45
• 2.3.1 米曲霉RNA的提取37
• 2.3.2 米曲霉乳糖酶的克隆37-38
• 2.3.3 乳糖酶基因序列分析38
• 2.3.4 乳糖酶基因序列优化38-41
• 2.3.5 乳糖酶基因表达载体的构建41-42
• 2.3.6 制备毕赤酵母感受态细胞42
• 2.3.7 重组酵母的构建及验证42-43
• 2.3.8 目的蛋白的表达测定43-45
• 2.4 本章小结45-46
• 第三章 毕赤酵母工程菌产乳糖酶发酵条件的优化46-58
• 3.1 材料46-47
• 3.1.1 菌株46
• 3.1.2 试剂46
• 3.1.3 培养基46
• 3.1.4 仪器46-47
• 3.2 方法47-49
• 3.2.1 乳糖酶活力的测定47
• 3.2.2 菌株活化与初筛47
• 3.2.3 碳源对乳糖酶发酵的影响试验47
• 3.2.4 碳源浓度对乳糖酶发酵的影响试验47-48
• 3.2.5 氮源对乳糖酶发酵的影响试验48
• 3.2.6 氮源浓度对乳糖酶发酵的影响试验48
• 3.2.7 无机盐离子浓度对乳糖酶发酵的影响试验48
• 3.2.8 发酵条件对乳糖酶发酵的影响试验48
• 3.2.9 碳源流加速度对乳糖酶发酵的影响试验48-49
• 3.2.10 50L发酵中试49
• 3.3 结果与讨论49-57
• 3.3.1 碳源对乳糖酶发酵的影响49-50
• 3.3.2 碳源浓度对乳糖酶发酵的影响50-51
• 3.3.3 氮源对乳糖酶发酵的影响51-52
• 3.3.4 氮源浓度对乳糖酶酶活的影响52-53
• 3.3.5 无机盐离子对乳糖酶酶活的影响53-54
• 3.3.6 发酵条件对乳糖酶发酵的影响54-55
• 3.3.7 碳源流加速度对乳糖酶发酵的影响55-57
• 3.3.8 50L中试发酵分析57
• 3.4 本章小结57-58
• 第四章 重组乳糖酶酶学性质的研究58-66
• 4.1 材料58
• 4.1.1 材料58
• 4.1.2 试剂与溶液58
• 4.1.3 仪器58
• 4.2 方法58-59
• 4.2.1 乳糖酶活力的测定58-59
• 4.2.2 乳糖酶样品的纯化与制备59
• 4.2.3 最适pH、pH稳定性的测定59
• 4.2.4 最适温度、热稳定性的测定59
• 4.2.5 金属离子及化学试剂对乳糖酶的影响59
• 4.3 结果与讨论59-64
• 4.3.1 乳糖酶样品的纯化与制备59-61
• 4.3.2 最适pH、pH稳定性的测定61-62
• 4.3.3 最适温度、热稳定性的测定62-64
• 4.3.4 金属离子及化学试剂的影响64
• 4.4 本章小结64-66
• 第五章 乳糖酶水解新鲜牛奶中乳糖的应用效果研究66-72
• 5.1 材料66
• 5.1.1 材料与试剂66
• 5.1.2 仪器66
• 5.2 方法66-67
• 5.2.1 乳糖酶活力的测定66
• 5.2.2 乳糖酶制剂的制备66
• 5.2.3 低乳糖牛奶的制备66-67
• 5.2.4 牛奶中乳糖含量的测定67
• 5.2.5 乳糖水解率的计算67
• 5.3 结果与讨论67-70
• 5.3.1 乳糖酶制剂的制备67
• 5.3.2 牛奶中乳糖含量的测定67-69
• 5.3.3 在37℃条件下的乳糖水解率69
• 5.3.4 在10℃和25℃条件下乳糖酶不同添加量对乳糖水解率的影响69-70
• 5.3.5 低乳糖牛奶的感官表现70
• 5.4 本章小结70-72
• 总结72-75
• 参考文献75-85
• 致谢85-86
• 攻读学位期间发表的学术论文目录86-87
• 附表87

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8 韩石;;基因工程[J];济宁医学院学报;1986年01期

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  本文关键词：基因工程法构建乳糖酶高产菌株及发酵条件优化的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：336206