布鲁氏菌外膜蛋白OMP31在细胞凋亡中的调控研究

发布时间：2017-04-30 04:15

  本文关键词：布鲁氏菌外膜蛋白OMP31在细胞凋亡中的调控研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：布鲁氏菌（Brucella）是一种可导致人及多种动物急性、慢性感染的革兰氏阴性、兼性胞内寄生菌。巨噬细胞是布鲁氏菌生存和繁殖的靶细胞，布鲁氏菌不但可寄生于巨噬细胞并可抑制其凋亡，布鲁氏菌外膜蛋白OMP31在布鲁氏菌的毒力及胞内寄生中均起重要作用，因此本研究欲构建布鲁氏菌omp31基因缺失株，，以巨噬细胞为研究对象探讨布鲁氏菌外膜 蛋白OMP31在巨噬细胞凋亡中不同阶段的作用。方法：本研究用PCR方法分别扩增omp31基因的侧翼序列及枯草芽孢杆菌SacB基因，利用双酶切的方法分别将三个片段连入自杀载体pGEM-7zf+，获得亚克隆pGEM-7zf+-omp31-SacB。将所构建好的自杀载体通过电转化转入布鲁氏菌16M感受态细胞中，经两次同源重组后筛选出16M omp31基因缺失株，对获得缺失株进行遗传稳定性检测及细菌学性质鉴定。分别收集2h、4h、8h、12h、24h不同时间段利用亲本株及缺失株侵染的小鼠巨噬细胞，利用流式细胞仪检测其不同时间段早期凋亡率；采用双抗体夹心ELISA的方法测定小鼠巨噬细胞不同时间段释放CytC以及细胞因子TNF-α的情况；通过QRT-PCR技术检测不同时间段TNF-α、Bax、Bcl-2mRNA表达量的变化。 结果：(1)成功获得16M omp31基因缺失株，在15代内未发生回复性突变说明缺失株具有遗传稳定性，细菌学性质鉴定表明其为布鲁氏菌羊种1型；(2)流式细胞仪检测表明缺失株明显促进感染巨噬细胞早期凋亡；(3)ELISA结果表明除2h外其他各时间点缺失株侵染的巨噬细胞释放的Cytc均高于亲本株侵染的巨噬细胞释放的Cytc；而各时间点缺失株侵染的巨噬细胞释放的TNF-α均高于亲本株；(4)利用QRT-PCR检测两者TNF-α mRNA表达量各时间点均处于上调，Bax mRNA表达量除4h外各时间点均处于上调，Bcl-2mRNA表达量除2h外，各时间点均处于下调。 结论：(1)成功构建布鲁氏菌16MΔomp31基因缺失株，缺失株可稳定遗传并未发生细菌学性质改变；(2)布鲁氏菌外膜蛋白OMP31参与了布鲁氏菌抑制感染细胞凋亡的过程；(3)omp31能通过调控凋亡通路中TNF-α、CytC、Bax、Bcl-2的表达量从而控制感染巨噬细胞的凋亡，本研究可为今后研究布鲁氏菌抗凋亡机制及慢性布病患者的药物选择奠定基础。
【关键词】：布鲁氏菌 omp31基因 缺失株 巨噬细胞 凋亡
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.5
【目录】：

• 摘要7-8
• Abstract8-9
• 主要符号表9-10
• 引言10-12
• 第一章 羊种布鲁氏菌 16M 标准株 omp31 基因缺失株的构建及稳定性检测12-33
• 摘要12
• 1 材料与方法12-20
• 1.1 材料12-13
• 1.2 方法13-20
• 2 结果20-31
• 2.1 同源重组质粒 pGEM-7zf+-Δomp31-SacB 的构建20-26
• 2.2 SacB 基因活性检测26-27
• 2.3 布鲁氏菌特异性检测27
• 2.4 同源重组的筛选27-29
• 2.5 布鲁氏菌 16MΔomp31 遗传稳定性检测29-30
• 2.6 16MΔomp31 常规细菌学鉴定结果30-31
• 3 讨论31-32
• 4 小结32-33
• 第二章 比较布鲁氏菌 16M 及 16MΔomp31 对小鼠巨噬细胞早期凋亡的影响33-46
• 摘要33-34
• 1 材料与方法34-37
• 1.1 材料34
• 1.2 方法34-37
• 2 结果37-43
• 2.1 布鲁氏菌 16M 及 16MΔomp31 侵染巨噬细胞早期凋亡的流式分析37-38
• 2.2 ELISA 检测巨噬细胞释放 Cytc38-39
• 2.3 ELISA 检测巨噬细胞释放细胞因子 TNF-α39-40
• 2.4 QRT-PCR 检测巨噬细胞 TNF-α、Bax、Bcl-2 mRNA 表达量40-43
• 3 讨论43-46
• 4 小结46
• 5 展望46
• 参考文献46-48
• 文献综述 布鲁氏菌外膜蛋白的研究进展48-67
• 参考文献60-67
• 致谢67-68
• 附录68-70
• 作者简介70-71
• 导师评阅表71

【参考文献】

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本文编号：336224