高致病性禽流感H5N1病毒血凝素中和抗体及表位鉴定和索瑞酶相互作用蛋白的筛选鉴定

发布时间：2017-04-30 04:17

  本文关键词：高致病性禽流感H5N1病毒血凝素中和抗体及表位鉴定和索瑞酶相互作用蛋白的筛选鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本论文由两部分内容组成：第一部分是对高致病性禽流感H5N1病毒血凝素中和抗体及表位的鉴定；第二部分是索瑞酶(Thorase)相互作用蛋白的筛选与鉴定。 高致病性禽流感病毒H5N1,属于甲型流感病毒,主要在禽类之间相互传播,导致数以百万计的家禽死亡。1997年在中国香港发生了全球首例人感染禽流感事件,引起了广泛关注,提示禽流感病毒有可能已突破物种间屏障,获得了直接感染人的能力。目前,虽然无确凿证据证明禽流感病毒可以在人群之间进行直接相互传播,然而,有文献报道,经过多次传代或者点突变的高致病性禽流感病毒H5N1能够在哺乳动物雪貂之间进行直接相互传播。因此,高致病性禽流感病毒H5N1对人类健康的可能威胁不容忽视。 H5N1病毒借助其包膜表面的血凝素(hemagglutinin, HA)与宿主细胞表面受体结合而感染宿主细胞。同时,HA也是宿主产生中和抗体的重要靶抗原。在抵抗高致病性禽流感H5N1病毒感染的免疫中,中和抗体能有效地阻断病毒感染及清除病毒已感染的细胞,是机体体液免疫应答的重要执行分子。因此,寻找H5N1的中和抗原表位是禽流感病毒中和抗体制备及免疫治疗研究的重要前提。 本课题组前期对四株H5N1病毒的HA基因,即香港(人)株A/Hongkong/213/03H5N1HA (HK-HA)、安徽(人)株A/Anhui/01/05H5N1HA (AH-HA)、新疆(人)株A/Xinjiang/01/06H5N1HA (XJ-HA)和青海(禽)株A/Bar-headed Goose/Qinghai/1/05H5N1HA (QH-HA)进行了分子流行病学和分子生物学分析证明,这些毒株涵盖了在中国境内流行的高致病性禽流感H5N1病毒的主要分枝。同时,利用抗HA的中和抗体筛选得到了6个HA候选中和抗原表位。 为进一步验证所筛选的HA候选中和抗原表位,本研究对6条多肽表位进行分析,利用表面线性表位抗体库(Surface Epitope Antibody Library, SEAL)技术表达多表位串联肽作为免疫原制备表位肽单克隆抗体,在H5N1假病毒水平和重组蛋白水平再次筛选鉴定,以获得针对单一表位的中和抗体。 为此,首先将候选的6条多肽氨基酸序列串联组合形成4条肽链,通过搭桥PCR方法和人工合成DNA方法获得了4条多表位肽(poly-epitope peptide, PEG)编码基因片段,然后连接到一种免疫增强载体,构建原核表达载体。采用大肠杆菌表达纯化重组多表位肽作为免疫原制备单克隆抗体,共获得了23株分泌高亲合力单克隆抗体。 随后,包装了5株高致病性禽流感H5N1假病毒,分别通过微量中和实验筛选具有高效中和活性的单克隆抗体；采用杆状病毒表达系统表达纯化重组HA,通过免疫印迹实验验证中和抗体识别并结合的蛋白；利用酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定中和抗体剂量依赖性结合多肽。 最后,从获得的23株单克隆抗体中,分离纯化出10株亚型为IgG的单克隆抗体,其中3株单克隆抗体对4株不同来源的H5N1假病毒具有高效的中和活性,并且均能与4种不同分枝的重组HA结合。HA144-153和154-163两个氨基酸区域的合成肽,能够被中和抗体识别,且其结合作用具有剂量依赖性,这提示,这两个区域为HA的中和抗原表位,为研制表位疫苗及抗体治疗奠定基础。 本文第二部分是筛选并鉴定与索瑞酶(Thorase)相互作用的蛋白。索瑞酶(Thorase)属于AAA+(ATPases Associated with diverse cellular Activities, AAA)ATP水解酶家族成员,是通过一种功能性筛选策略发现的对神经元具有保护作用的新蛋白。本课题组前期采用蛋白芯片高通量筛选出375个与Thorase相互作用的蛋白,并对这些蛋白进行分类分析。本研究在蛋白芯片的结果中挑选出37个本课题组感兴趣的蛋白分子,然后采用GatewayTM技术构建带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的重组靶蛋白载体,分别将含有GFP标签的靶蛋白质粒与Thorase载体共转染HEK293T细胞,用特殊的GFP抗体偶联的琼脂糖珠捕获GFP融合蛋白,免疫共沉淀方法验证,结果发现有11个蛋白与Thorase相互作用。该研究为进一步阐明Thorase的生物学功能奠定了基础。
【关键词】：H5N1禽流感 血凝素 假病毒 中和抗体 索瑞酶 免疫共沉淀
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 目录3-4
• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 英文缩略词表9-11
• 第一部分 高致病性禽流感H5N1病毒血凝素中和抗体及表位的鉴定11-33
• 前言11-12
• 实验材料12-18
• 实验方法18-26
• 实验结果26-31
• 讨论31-33
• 第二部分 索瑞酶相互作用蛋白的筛选与鉴定33-48
• 前言33-35
• 实验材料35-38
• 实验方法38-43
• 实验结果43-47
• 讨论47-48
• 参考文献48-52
• 综述：AMPA受体在突出可塑性中的研究进展52-62
• 参考文献57-62
• 个人简历62-63
• 致谢63-64

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