鼠疟原虫TatD-like DNase序列的表达与分析

发布时间：2017-04-30 05:01

  本文关键词：鼠疟原虫TatD-like DNase序列的表达与分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：疟疾是由疟原虫引起并经蚊虫传播的一种重要的寄生虫病，主要流行于热带和亚热带地区。它和艾滋病及结核病一起被认为是对人类危害最严重的传染病。疟原虫的免疫逃避机制十分复杂，这也正是导致疟疾疫苗研究困难的原因之一。对恶性疟疾的主要病理组织研究发现，在有大量恶性疟原虫虫体聚集的地方，却没有明显的类似于细菌或病毒感染时引发的炎症反应，巨噬细胞和其它淋巴细胞的聚集基本上和正常组织相类似，并且很少有嗜中性粒细胞出现。这表明，，疟原虫可能具有拮抗宿主天然免疫的作用。在机体固有免疫应答中，最新研究发现了中性粒细胞抵御病原微生物的另一种新机制：它们在被称为NETosis的一种主动性死亡过程中将染色质及胞浆内的溶酶体颗粒一起释放到胞外，形成网状结构（neutrophil extracellular traps (NETs)）以捕获并杀死病原微生物，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、原生动物和病毒。病原微生物可通过分泌一种DNase来降解这种NETs结构的骨架分子DNA，破坏NETs对病原微生物的作用，进而逃避宿主的先天性免疫清除。DNase是病原微生物逃避NETs攻击的有效武器，与病原微生物的毒力强弱相关。目前认为DNase是病原生物的重要毒力/致病相关因子。对几种疟原虫基因组分析结果表明，疟原虫基因组中编码的TatD-like DNase在各种疟原虫中序列非常保守，且它们的N-末端均含有一个信号肽序列。在空间结构上与大肠杆菌的TatD DNase非常接近，而TatD DNase在大肠杆菌中是一种具有降解DNA活性的蛋白质。由此推测，疟原虫可分泌表达一种具有DNA酶活性的蛋白质分子TatD-like DNase。本研究的目的是对TatD-like DNase在三种鼠疟原虫中的表达情况进行鉴定，研究该蛋白质与疟原虫致病的相关性。 本研究首先对本实验室保存的重组质粒pUC19-PCH、pUC19-PB和pUC19-PY分别用BamHI和XhoI进行双酶切，得到目的片段PCH、PB和PY。将目的片段分别克隆到pET-28a和pGEX-4T-1表达载体中，构建重组表达质粒，然后转化基因工程菌E.coli BL21。诱导表达后，利用亲和层析的方法纯化获得了三个His标签重组蛋白质和三个GST标签重组蛋白质。经Western-blot分析，重组蛋白质His-PCH、His-PB、GST-PCH和GST-PB的分子量大小与软件预测值一致，而His-PY和GST-PY重组蛋白质的分子量较预测值偏小约4kDa。 利用纯化获得的His标签重组蛋白质作为抗原，与弗氏佐剂乳化后免疫家兔。ELISA法检测血清效价达1：16000后，通过心脏采血，收集抗血清。利用Protein A亲和层析的方法纯化获得了高纯度的特异性抗体IgG，以用于对三种鼠疟原虫TatD-like DNase表达情况的Western-blot和间接免疫荧光分析。 每只Balb/c小鼠腹腔注射1×105感染疟原虫的红细胞。当小鼠红细胞染虫率达50%以上时，摘除眼球采血，收集血细胞。利用含0.1%Saponin的PBS裂解红细胞，离心，收集虫体。利用Western-blot对染虫红细胞和虫体样品进行分析，一抗为本实验制备的抗TatD-like DNase的IgG，二抗为碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG。结果显示，在染虫红细胞和虫体样品的泳道均检测有特异性条带，阴性对照没有，这表明P.chabaudi chabaudi AS、P.bergher NK65和P.yoelii YM均表达TatD-like DNase蛋白质。此结果同时表明了，本实验制备的多克隆抗体能够特异性地识别虫体表达的TatD-like DNase分子。当小鼠红细胞染虫率达10%时，经尾尖采血制片，用4%多聚甲醛固定红细胞，以实验制备的抗TatD-like DNase IgG为一抗，以Alexa Fluor488山羊抗兔IgG为二抗，进行间接免疫荧光分析。结果显示，在纳虫泡内和染虫红细胞周围均能观察到特异性绿色荧光，阴性对照没有，这表明TatD-like DNase在三种鼠疟原虫中确有表达且可分泌到虫体外。本研究为进一步研究TatD-like DNase的功能及其与虫体致病的相关性奠定了基础，同时也为新型抗疟药物和高效疟疾疫苗的研发奠定了基础。
【关键词】：重组蛋白质 多克隆抗体 TatD-like DNase 鼠疟原虫
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R382.31
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 前言12-14
• 第一篇 文献综述14-24
• 第1章 疟原虫免疫逃避机制研究进展14-24
• 1.1 疟原虫与疟疾的概述14-16
• 1.2 疟原虫的免疫逃避机制16-22
• 1.3 展望22-24
• 第二篇 研究内容24-71
• 第1章 鼠疟原虫 TatD-like DNase 序列的原核表达及纯化24-49
• 1.1 材料24-28
• 1.2 方法28-37
• 1.3 结果37-45
• 1.4 讨论45-48
• 1.5 小结48-49
• 第2章 抗 TatD-like DNase 多克隆抗体的制备49-58
• 2.1 材料49-51
• 2.2 方法51-54
• 2.3 结果54-56
• 2.4 讨论56-57
• 2.5 小结57-58
• 第3章 TatD-like DNase 在三种鼠疟原虫中表达情况的鉴定58-71
• 3.1 材料58-59
• 3.2 方法59-62
• 3.3 结果62-68
• 3.4 讨论68-70
• 3.5 小结70-71
• 结论71-72
• 参考文献72-80
• 导师简介80-81
• 作者简介81-82
• 致谢82

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王宪锋,薛采芳,甄荣芳;恶性疟原虫红细胞膜蛋白 1在疟原虫免疫逃避中的作用[J];地方病通报;2000年02期

2 贾默稚,高兴政;恶性疟原虫的抗原变异与var基因家族[J];国外医学(寄生虫病分册);1999年03期

3 王小环;杨莲如;赵林立;吴绍强;;免疫荧光检测技术及其在寄生虫检测中的应用进展[J];中国畜牧兽医;2012年03期

4 张小霞,严卫星,徐海滨;外源蛋白质表达系统类型的研究进展[J];国外医学(卫生学分册);2004年04期

5 王娜;恶性疟原虫的基因表达水平对密码子使用的影响[J];国外医学(寄生虫病分册);2005年01期

6 高艳利;杨思文;樊凯奇;陈静;王娟;;SDS-PAGE电泳技术分析蛋白质的研究[J];辽宁化工;2007年07期

7 肖丹;龙泳;王善青;;国内外疟疾疫情的研究进展[J];中国热带医学;2010年01期

8 李节;何永蜀;杨照青;;恶性疟原虫var基因相关研究新进展[J];热带医学杂志;2009年02期

9 车河龙;林栋;;疟疾的防控现状及进展[J];热带医学杂志;2010年02期

10 王宇;沈玉栋;雷红涛;刘文字;王弘;孙远明;;免疫分析标记技术研究进展[J];食品工业科技;2007年10期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 杜承;恶性疟原虫Pf332抗原的免疫原性分析[D];吉林大学;2010年

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 张娜;恶性疟原虫转录因子的克隆表达及多克隆抗体的制备[D];吉林大学;2009年

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本文编号：336264