川芎嗪体外诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞

发布时间：2017-04-30 11:11

  本文关键词：川芎嗪体外诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：从新生儿脐带分离并培养脐带间充质干细胞，对其细胞表型进行鉴定；观察不同浓度川芎嗪在体外诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的作用，初步探讨人脐带间充质干细胞向神经样细胞分化的机制。 方法：取足月妊娠剖宫产健康胎儿的脐带，剔除脐动脉和脐静脉，以D-Hank’s充分冲洗，将剩余的脐带间质组织切割成1mm3大小的组织块，0.2%胶原酶Ⅱ消化，在含有20%胎牛血清（FBS）、2ng/ml表皮细胞生长因子（EGF）、25mM左旋谷氨酰胺（L-Glu）、100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的DMEM/F12中培养。观察原代培养细胞的形态学变化，当细胞达80％～90％融合时，加入0.25%胰酶-1mM EDTA消化细胞，并传代。 收集消化后的细胞，采用流式细胞术行细胞表型检测，包括CD73、CD90和CD105、CD19、CD34、CD45、CD11和组织相容性抗原HLA-DR(MHC-II)，以抗鼠IgG1-PE和IgG1-FITC作为同型对照。 原代hUMSCs按1:1的比例传代后是为P1代，倒置显微镜下观察形态变化，细胞达到90%以上融合时按1:2或1:3比例进行传代，绘制细胞生长曲线。 扩增后取第5代细胞，接种于四个六孔细胞培养板中继续培养，每孔加入全培养基2.5mL，培养方法同细胞培养瓶，将四个六孔板随机分为A、B、C、D四组，待各组培养的细胞融合至70%时，弃去培养基，PBS轻轻洗涤2次，前三组设为含不同浓度川芎嗪诱导液的实验组，浓度依次为：A组4.67mg/mL、B组2.34mg/mL、C组1.17mg/mL，诱导液用不含血清的L-DMEM培养基配制，D组设为对照组，只含L-DMEM培养基。观察四组诱导hUMSCs向神经样细胞分化情况，每0.5h倒置相差显微镜观察诱导后细胞形态的变化，连续观察6小时，第6小时用免疫细胞化学染色方法检测神经细胞表面标志神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF-H）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达情况，并计算阳性细胞率，结果以X±s表示。 结果：原代细胞接种12h后多数细胞贴壁，细胞最初呈菱形、椭圆形生长，随培养时间延长，细胞数量逐渐增多，细胞形态变为更为均一的长梭形，当细胞融合至90%时，低倍镜下细胞排列为放射状、旋涡状生长。连续传代后仍保持旺盛的增殖能力。 流式细胞术检测P3、P5和P10代细胞表面分子标记，结果显示各代均表达CD73、CD90和CD105，而不表达CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR。 A组加入诱导液后0.5h可见约40%细胞收缩成椭圆形或球形，并伸出多条细长的突起，1h时神经样细胞的比例可达55%左右，细胞进一步收缩，突起伸长，相邻细胞突起相互连接成网状，1.5h可见85%左右的神经样细胞，4h可见部分神经样细胞开始脱落6h神经样细胞比例约80%。B组加入诱导液后1.5h细胞发生明显变化，可见45%左右的神经样细胞，至第2h达80%，之后可见零星神经样细胞脱落，至第6h该比例降至70%左右。C组细胞于诱导后4.5h可见30%左右的神经样细胞，，但伴随着细胞的脱落，至第6h该比例为55%左右。对照组细胞形态诱导前后未见明显变化。诱导至第6小时，免疫细胞化学检测显示实验组各组神经样细胞神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF-H）表达阳性，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达阴性，A组（4.67mg/mL组）细胞NSE、NF-H阳性表达率最高。对照组诱导前后无明显变化。 结论:hUCMSCs可以在体外稳定培养、传代，并保持较高的增殖能力；传代后的hUCMSCs均表达间充质干细胞表面标志CD73、CD90和CD105，不表达造血细胞表面标志CD34、CD45、CD19、CD11b和组织相容性抗原HLA-DR （MHC-Ⅱ）；TMP在体外可有效诱导hUCMSCs分化成神经样细胞，并表达成熟神经细胞标志神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF-H），4.67mg/mL为最合适诱导剂量。
【关键词】：川芎嗪 人脐带间充质干细胞 分化 神经样细胞 免疫细胞化学染色
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 前言9-10
• 材料与方法10-16
• 结果16-19
• 附图19-30
• 附表30-31
• 讨论31-33
• 结论33
• 参考文献33-36
• 综述 不同诱导液体外诱导间充质干细胞向神经样细胞分化及其机制的研究36-44
• 参考文献41-44
• 致谢44-45
• 个人简历45

【参考文献】

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本文编号：336749