硝苯地平对RAW264.7小鼠巨噬细胞胆固醇外流影响的试验研究

发布时间：2017-05-01 02:11

  本文关键词：硝苯地平对RAW264.7小鼠巨噬细胞胆固醇外流影响的试验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景与目的 巨噬细胞在动脉粥样硬化发生发展过程中扮演着关键角色，巨噬细胞来源的泡沫细胞存在于动脉粥样硬化病变的各个阶段，在各种促动脉粥样硬化因素的作用下，血液中的单核巨噬细胞侵入动脉血管内皮下吞噬脂蛋白，在细胞质中沉积大量胆固醇酯形成泡沫细胞，并促进病灶逐步发展。胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport，RCT)可促进外周组织和巨噬细胞等细胞内胆固醇的清除，延缓动脉粥样硬化的发生与发展，是机体抗动脉粥样硬化最重要的机制之一。 既往多项研究表明硝苯地平具有抗动脉粥样硬化效应；但硝苯地平抗动脉粥样硬化效应具体机制未明确，硝苯地平逆转动脉粥样硬化斑块是否与增强病变巨噬细胞胆固醇外流作用相关未见报道。本研究拟使用硝苯地平干预RAW264.7小鼠巨噬细胞，探讨硝苯地平对RAW264.7小鼠巨噬细胞胆固醇外流影响及其具体机制。 方法 1. RAW264.7细胞以1×10~5／ml密度种植在24孔板中，每孔加入3H标记的胆固醇1微居(7.4x103iq／ml)孵育12h。用PBS漂洗3次后加入硝苯地平浓度分别为0nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L无血清DMEM细胞培养液各3ml，孵育48小时。将细胞培养液置换为3ml无血清含ApoA-I (10μg/mL)或HDL (50μg/mL)的DMEM细胞培养液,孵育24小时后检测每细胞培养孔的RAW264.7巨噬细胞胆固醇外流率变化。 2.浓度分别为1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L的硝苯地平干预RAW264.7细胞24小时后，，使用RT-PCR检测ABCA1、ABCG1、SR-BI、LXRα基因mRNA表达水平；浓度分别为1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L的硝苯地平干预RAW264.7细胞48小时后，使用Western blotting方法检测ABCA1、ABCG1、SR-BI、LXRα基因蛋白表达水平。 3. RAW264.7细胞以1×10~7／ml密度种植在培养瓶中培养24小时，用PBS清洗1次后各加入硝苯地平浓度各为0nmol/L、0nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L。向第一瓶细胞中加入阴性对照siRNA，向第二至第五瓶中加入LXRα siRNA培养96小时后使用Western blotting方法检测ABCA1、ABCG1、SR-BI、LXRα基因蛋白表达情况。 4. RAW264.7细胞以1×10~5／ml密度种植在24孔板中，每孔加入~3H标记的胆固醇1微居(7.4x10~3iq／ml)孵育12h，用PBS漂洗2次后各加入硝苯地平浓度各为0nmol/L、0nmol/L、1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L无血清的DMEM细胞培养液。向第一孔细胞中加入阴性对照siRNA，向第二至第五孔中加入第二对LXRα siRNA，孵育48小时。将细胞培养液置换为3ml无血清含ApoA-I (10μg/mL)或HDL (50μg/mL)的DMEM细胞培养液,孵育24小时后检测每细胞培养孔的RAW264.7巨噬细胞胆固醇外流率变化。 结果 1.与对照组比较，浓度为1,10,100nmol/L的硝苯地平明显增加ApoA-I介导的巨噬细胞胆固醇外流(巨噬细胞胆固醇外流率分别从2.55%提高到5.65%,6.20%,6.10%，p0.05)；与对照组比较，浓度为1,10,100nmol/L的硝苯地平明显增加HDL介导的巨噬细胞胆固醇外流(巨噬细胞胆固醇外流率分别从31.0%增加42.5%,46.0%,43.5%, p0.05) 2.与对照组比较，浓度为1,10,100nmol/L的硝苯地平明显增加RAW264.7巨噬细胞ABCA1、ABCG1、SR-BI、LXRα基因mRNA表达水平(405%,381%,336%；890%,960%,1002%；285%,325%,336%；482%,445%,405%；分别, p0.05)；与对照组比较，浓度为1,10,100nmol/L的硝苯地平明显增加RAW264.7巨噬细胞ABCA1、ABCG1、SR-BI、LXRα基因蛋白表达水平(428%,492%,361%；288%,331%,365%；283%,320%,505%；581%,678%,608%；分别, p0.05)。 3. LXRα siRNA干预后，硝苯地平对RAW264.7巨噬细胞胆固醇外流相关基因的刺激作用均受抑制。 4. LXRα siRNA干预LXRα后，硝苯地平对RAW264.7巨噬细胞胆固醇外流的促进作用均受抑制。 结论： 1.硝苯地平增强巨噬细胞胆固醇外流，减少细胞内胆固醇蓄积，防止巨噬细胞泡沫化。 2.硝苯地平明显增强RAW264.7巨噬细胞ABCA1、ABCG1、SR-BI、LXRα基因mRNA及蛋白表达水平(P0.05)。 3. LXRα siRNA干预LXRα基因表达后，硝苯地平对RAW264.7巨噬细胞胆固醇外流相关基因的增强作用受抑制。 4. LXRα siRNA干预LXRα基因表达后，硝苯地平对RAW264.7巨噬细胞胆固醇外流的增强作用受抑制。
【关键词】：胆固醇逆向转运 动脉粥样硬化 脂蛋白A-I 高密度脂蛋白 肝X受体
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 缩略语表5-7
• Abstract7-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-16
• 第二章 硝苯地平对 RAW264.7 巨噬细胞胆固醇外流的影响16-26
• 2.1 材料和方法16-19
• 2.2 结果19
• 2.3 讨论19-25
• 2.4 小结25-26
• 第三章 硝苯地平对巨噬细胞胆固醇外流相关基因表达的影响26-38
• 3.1 材料和方法26-33
• 3.2 结果33-35
• 3.3 讨论35-37
• 3.4 小结37-38
• 第四章 LXRa siRNA 干扰 LXRa 基因表达的检测38-52
• 4.1 有效 LXRa siRNA 片段的筛选38-41
• 4.1.1 材料和方法38-39
• 4.1.2 结果39
• 4.1.3 讨论39-41
• 4.1.4 小结41
• 4.2 LXRα siRNA 干扰后相关基因的 Western blotting 检测41-47
• 4.2.1 材料和方法41-44
• 4.2.2 结果44-46
• 4.2.3 讨论46
• 4.2.4 小结46-47
• 4.3 LXRa siRNA 干扰后 RAW264.7 细胞胆固醇外流率变化47-52
• 4.3.1 材料和方法47-49
• 4.3.2 结果49-50
• 4.3.3 讨论50-51
• 4.3.4 小结51-52
• 全文总结52-53
• 参考文献53-60
• 文献综述 肝 X 受体对调节胆固醇代谢的调控60-71
• 参考文献66-71
• 研究生阶段发表文章71-72
• 致谢72

【共引文献】

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本文编号：338025