异种移植人脐带间充质干细胞在大鼠肝切除模型发生病理学反应

发布时间：2017-05-01 04:12

  本文关键词：异种移植人脐带间充质干细胞在大鼠肝切除模型发生病理学反应，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景 20世纪医学界最杰出的成就之一是人类移植学的发展，而输血技术则是人类最早的细胞移植，进入21世纪后，临床细胞移植术进一步发展，其代表性的成果自然是骨髓移植和同种胰岛移植，近20年来，由于临床移植受体的大量增加，供体显著短缺，干细胞移植成为生命科学领域的另一研究热点，部分学者已经认为干细胞移植是治疗器官终末期病变的有效手段之一。 细胞移植是指将适量游离的具有某种功能的活细胞输注到受体的血管、体腔或组织器官内，由于间充质干细胞具有多向分化潜能、低免疫原性及免疫调节功能,在理论上肯定了干细胞移植的优势。Lu等[1]发现脐血间充质干细胞不表达MHC-Ⅱ分子，低水平表达MHC-Ⅰ分子, Ⅰ类分子是由非共价键连接的两条肽链组成的糖蛋白,分布于几乎所有有核细胞表面，其重要生理功能是对CD8T细胞的抗原识别功能起限制性作用，主要介导Tc细胞的细胞毒作用，是重要的移植抗原；Ⅱ类分子的分布比较局限，主要表达于B细胞、单核－巨噬细胞和树突状细胞等抗原递呈细胞上，是引起移植排斥反应的重要靶抗原，包括引起宿主抗移植物反应（Host versus graft reaction，hvgr）和移植物抗宿主反应（Graft-versus-host reaction，gvhr），理论上间充质干细胞具有低免疫原性。在过去10年里，大量的文献还反映出间充质干细胞具强大的免疫抑制作用，Prigione等[2]发现间充质干细胞抑制细胞毒性CD4~+、CD8~+T细胞的增殖，减少干扰素的产生，也一定程度上抑制自然杀伤细胞和γδT细胞的增殖和功能。鉴于上述特点，将绿色荧光蛋白标记的人脐带间充质干细胞移植入与人类有相似器官、相近基因的大鼠体内，观察异种移植细胞能否在大鼠体内存活、分化，为人脐带间充质干细胞的应用提供实验依据。 本文分两部分，分别探讨以下问题：（1）研究人脐带间充质干细胞分离、培养、鉴定的方法；（2）制备大鼠部分肝切除模型，利用慢病毒载体介导EGFP转染人脐带间充质干细胞，将标记细胞移植入肝损伤大鼠体内，观察人脐带间充质干细胞的存活、分化及再生肝组织病理、肝脏功能的变化，探讨间充质干细胞能否用于异种移植。 第一部分人脐带间充质干细胞的分离、培养与鉴定 目的：研究人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法，观察其生物学特性。 方法：青年健康孕妇足月后行剖宫产术，术中获得无菌脐带组织，应用胶原酶Ⅱ消化筛选人脐带间充质干细胞，通过观察细胞形态、流式细胞仪检测细胞表面标志物以及对其进行成骨、成脂诱导分化培养，对培养的人脐带间充质干细胞进行鉴定。 结果：运用胶原酶消化法可以获得纯化的人脐带间充质干细胞。该方法获得的人脐带血间充质干细胞贴壁生长，经传代，呈典型的长梭形，可涡旋或放射排列；流式细胞仪技术检测该细胞的表面标志物，高度表达CD90、CD73、CD105，不表达或低表达CD34、CD31、HLA-DR；成脂诱导两周，经油红“O”染色，镜下可见脂滴呈红色，成骨诱导3周，经茜素红染色，镜下可见深红的钙盐沉淀。上述结果均符合典型的生物学间充质干细胞特征。 结论：胶原酶消化法可以获得高度纯化的人脐带间充质干细胞，以供本研究使用。 第二部分人脐带间充质干细胞异种移植的可行性分析 目的：探讨人脐带间充质干细胞能否在大鼠体内存活、分化，及观察异种移植人脐带间充质干细胞对大鼠肝损伤修复的影响。 方法：取生长活跃的293T细胞，以慢病毒为载体，增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）为目的基因，以不同的感染复数（Multiplicity of infection，，MOI）感染293T细胞，收集富含EGFP慢病毒颗粒的细胞上清，浓缩后计算病毒浓度，以1:100的感染复数感染人脐带间充质干细胞，经激光共聚焦显微镜检测干细胞内EGFP的表达；成功标记后，人脐带间充质干细胞经门静脉注入肝部分切除的大鼠体内，术后3个月，以胶原酶法分离肝组织细胞，同时制作再生肝叶的病理切片，以确定干细胞的存活、分化状态及肝组织修复情况，经腹主动脉抽血检测实验组、模型组与对照组的肝功能的差异。 结果：转染成功的人脐带间充质干细胞在荧光显微镜下呈绿色梭形，绿色荧光充满胞浆；移植术后3个月，病理切片提示模型组为正常肝组织，实验组肝组织结构较模型组紊乱，汇管区炎细胞浸润明显，肝细胞内淤胆，血管内有微栓形成，部分坏死的干细胞团栓塞肝内血管，分离获得的部分细胞在共聚焦显微镜下发出较弱的绿光，胞核成多核样改变；模型组肝功能明显优于实验组（P0.05）。 结论：异种移植人脐带间充质干细胞在观察期内部分存活于大鼠体内并分化，但实验组病理切片提示明显的病理学反应，转氨酶水平也高于其余两组，结合异种移植的本质，大鼠的肝脏可能无法给植入的人间充质干细胞提供完全适宜增殖和分化的微环境。
【关键词】：人脐带间充质干细胞 分离 鉴定 增强型绿色荧光蛋白 转染 异种移植
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R657.3;R-332
【目录】：

• 中文摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 符号说明11-12
• 前言12-18
• 参考文献13-18
• 第一部分 人脐带间充质干细胞的分离、培养与鉴定18-31
• 前言18
• 材料和方法18-23
• 结果23-25
• 讨论25-28
• 结论28
• 参考文献28-31
• 第二部分 EGFP 标记的人脐带间充质干细胞行异种移植的可行性分析31-46
• 前言31
• 材料和方法31-36
• 结果36-40
• 讨论40-42
• 结论42
• 参考文献42-46
• 综述一46-54
• 参考文献51-54
• 综述二54-63
• 参考文献60-63
• 致谢63-64
• 附录-Ⅰ 校期间发表的论文64-65
• 附录-Ⅱ 附图65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 万汇涓,张芳婷,龙霞,叶静,于洁,房家智;人脐血细胞在肝损伤裸鼠体内向肝细胞的分化[J];解剖学报;2005年05期

2 韩翠萍;刘吉勇;高蕾;裴庆山;孙欣欣;文婷玉;;脐血间充质干细胞的体外扩增及向类肝细胞分化的实验研究[J];山东医药;2010年07期

3 唐晓琼;赵智刚;王红祥;李秋柏;邹萍;;人脐静脉来源间充质干细胞向神经样细胞分化的体外分离扩增实验[J];中国临床康复;2005年42期

  本文关键词：异种移植人脐带间充质干细胞在大鼠肝切除模型发生病理学反应，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：338205