DMOG对兔骨髓间充质干细胞体外增殖与成骨分化影响的实验研究

发布时间：2017-05-01 07:11

  本文关键词：DMOG对兔骨髓间充质干细胞体外增殖与成骨分化影响的实验研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的 探讨脯氨酸羟化酶抑制剂二甲基乙二酰基甘氨酸(Dimethyloxalyl glycine, DMOG)对兔骨髓间充质干细胞体外增殖和成骨分化的影响,为DMOG进一步进行体内试验提供理论支撑。 方法 取正常健康的新西兰大白兔1只,予以3%戊巴比妥静脉麻醉,无菌操作下取出双后侧股骨干,用DMEM/F12完全培养液冲洗髓腔,得到细胞悬液,用贴壁法去除未贴壁的细胞及多次传代纯化细胞。 第一步：对骨髓间充质干细胞进行分离、培养和鉴定； a于第1d、3d、7d、12d分别对原代细胞和传代细胞进行细胞形态的观察； b对第2代和第5代的的细胞在1d,3d,5d,7d,9d,11d时分别对细胞生长动力学进行检测； c细胞免疫化学检测P3细胞表面的CD44表达； d配制7组不同浓度的DMOG溶液(浓度范围调整为100umol/L-2000umol/L),并设置单纯培养液作为对照,观察不同浓度的DMOG溶液对细胞的光密度值和ALP表达的影响。 第二步：取传代至第3代的骨髓间充质干细胞,按培养液的不同,将P3代细胞分为三组,A组含500umol/LDMOG的成骨诱导分化剂培养液组B组含成骨诱导分化剂的培养液组C组单纯的培养液组, a、于14天和21天时,用Gomori钙钴法观察3组培养溶液对BMSCs碱性磷酸酶表达的影响和用Von-Kossa改良染色法观察3组培养溶液对BMSCs成骨分化中钙沉积的影响： b、于5d、10d、15d、20d时,用MTB比色法对三组细胞内钙离子进行定量检测,所得数据以均数±标准差(x±s)表示,统计方法采用单因素方差分析,数据采用SPSS17.0进行分析； c、于5d、10d、15d、20d时,用ELISA法对三组细胞内对骨钙素蛋白进行检测,所得数据以均数±标准差(x±s)表示,统计方法采用单因素方差分析,数据采用SPSS17.0进行分析； 结果 培养48小时即可见细胞贴壁生长,类似成纤维细胞样,约96小时后,细胞形态开始转变为长梭形,多次对细胞进行换液,对纯化后的细胞用免疫化学法进行检测,结果表明我们所分离的骨髓单个细胞CD44(+)； 当DMOG浓度为100umol/L-500umol/L时,随着DMOG溶液浓度增加,培养的细胞OD值不断下降,但碱性磷酸酶的表达不断上调,对数据予以统计学分析,发现：100umol/L-500umol/L内各组DMOG溶液对细胞的增殖有抑制作用,但P0.05,差异无统计学意义,对ALP的表达进行分析时得出P0.05,差异有统计学意义； 当DMOG浓度为500umol/L-2000umol/L时,随着DMOG溶液浓度增加,培养的细胞OD值不断下降,并且碱性磷酸酶的表达不断下调,对数据予以统计学分析,发现：500umol/L-2000umol/L内各组DMOG溶液对细胞的增殖有抑制作用,且P0.05,差异有统计学意义,对ALP的表达进行分析时得出P0.05,差异有统计学意义； 检测碱性磷酸酶的Gomori钙钴染色法表明,含500umol/LDMOG的培养液能明显上调细胞成骨分化中ALP的表达,检测钙沉积的Von-Kossa改良染色法表明,含500umol/LDMOG的培养液能明显使钙沉积增加； 用MTB染色法对钙进行定量检测,得出含500umol/LDMOG的培养液能使钙含量明显增加,与其他两组相比,P0.05,差异有统计学意义； 用ELISA法对细胞内骨钙素蛋白的表达进行定量检测,得出含500umol/LDMOG的培养液能使骨钙素表达明显上调,与其他两组相比,P0.05,差异有统计学意义； 结论 1.实验中所获的骨髓单个核细胞就是骨髓间充质干细胞。 2.当DMOG浓度为100umol/L-500umol/L时,与其余各组比较,DMOG对细胞的增殖抑制作用差异无统计学意义,但对ALP的表达是增强的,差异有统计学意义； 当DMOG浓度为500umol/L-2000umol/L时,与其余各组比较,DMOG对细胞的增殖抑制作用差异有统计学意义,细胞内ALP表达量也逐渐下调,差异具有统计学意义,即随着浓度的增加,其对增殖的抑制作用逐渐增强,且细胞内ALP的表达逐渐下调； DMOG浓度为500umol/L时,对细胞的增殖的抑制作用最小,并且对ALP的表达效果最强； 3.含500umol/LDMOG的培养液能明显增加BMSCs成骨分化中的钙含量与上调BMSCs成骨分化中的骨钙素表达。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 脯氨酸羟化酶抑制剂二甲基乙二酰基甘氨酸 细胞增殖 成骨分化 钙定量检测
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329
【目录】：

• 英文缩略词表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-16
• 参考文献14-16
• 材料与方法16-27
• 结果27-44
• 讨论44-50
• 结论50
• 课题的局限性50-51
• 参考文献51-56
• 综述56-63
• 参考文献60-63
• 攻读硕士学位期间发表论文的情况63-64
• 致谢64

【参考文献】

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1 吴洪福;邓宇斌;严云发;全大萍;司美君;;Pluronic F-127水凝胶复合骨髓间充质干细胞构建组织工程化脂肪的体外研究[J];生物医学工程学杂志;2011年06期

  本文关键词：DMOG对兔骨髓间充质干细胞体外增殖与成骨分化影响的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：338468