基于细胞穿透肽的Cre-LoxP重组酶系统的改造

发布时间：2017-05-01 08:09

  本文关键词：基于细胞穿透肽的Cre-LoxP重组酶系统的改造，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：1988年,美国的Green Loewenstein和Frankel Pabo首次报道并证实了I型人免疫缺陷病毒反式转录激活蛋白(Human immunod eficiency virus transactivaloroftronscription, HIV-1) Tat多肽能单独穿过多种细胞的细胞膜,从此揭开了对细胞穿透肽(cell penetrating peptides, CPP)研究的序幕；1994年,FaweH等报道Tat能介导外源性蛋白进入细胞,并确定了其蛋白内化的Tat蛋白的最短序列是包含了11个氨基酸的47-57位氨基酸序列,该序列被称为"Tat蛋白转导结构”(peptide transduction domain, PTD),此发现誉为是CPPs发展史的一个重要里程碑；1997年,Heitz和Divita课题组设计了第一个CPP,能以非共价结合的方式输送核酸进入细胞,从此开启了人工设计合成CPP的大门；CPPs领域的另一个重大突破是Dowdy课题组首次进行了CPP体内物质转运试验,他们利用Tat47-57与大分子蛋白β-半乳糖苷酶(p-galactosidase,P-Gal)连接,腹腔注射到小鼠体内,观察组织切片染色结果。实验发现,Tat47-57可携带β-Gal进入包括脑在内的体内多个组织器官,从此CPPs的研究由体外迅速扩展至体内。于此同时越来越多的CPPs被研究人员发现,如果蝇的转录因子Antennapedia (Antp)、疱疹病毒的VP22蛋白人周期蛋(human period 1)、信号转导蛋白Syn B1、纤维母细胞生长因子FGF-4、融合蛋白gp41、外毒素A、g分泌酶和朊病毒等大量自然界的蛋白质中都发现了具有穿膜效应的多肽序列。现已明确,CPPs是一类能携带外源物质的多肽,氨基酸长度常少于30,常又被称为膜穿透肽(membrane penetrating peptide, MPP)、蛋白转导区(proteintransduction domain, PTD)或膜转位序列(membrane translocation sequence)。它不仅可以穿透细胞膜,还可以作为载体将不同种类的外源物质导入种类广泛的细胞中。根据细胞穿透肽的来源,我们可以将其分为天然蛋白来源的天然肽、天然蛋白来源的嵌合肽和人工设计的合成肽。如下表：至今在体内由CPP介导的外源物质转运已超过了300种。外源物质主要分为三类：蛋白质、核酸和少量小分子其它物质。其中蛋白质类外源性物质包括酶类、细胞凋亡因子、蛋白质类激素、分子伴侣以及细胞内信号转导分子等功能蛋白质,如超氧化物歧化酶、细胞凋亡调控因子p53、神经营养因子、热激蛋白27和Rho蛋白等。核酸类外源性物质包括质粒、双链DNA、反义寡核苷酸和干扰小RNA(small interfering RNA, siRNA)等；其它物质有染料(医学影像)、200 nm的脂质体、噬菌体和超顺磁性粒子等。相对于其他运输的载体,CPPs具有操作简单,作用迅速,转导效率高,相对安全,对细胞损害相对较小等优点。因此,近年来CPPs受到国内外的广泛关注,研究主要集中在应用与穿膜的机制两个方面。于此同时目前CPP向体内和体外输送物质的方法逐渐变得成熟。在基础研究领域,已成为研究细胞内分子相互作用的有用工具；在应用方面,CPP连接的一些药物已进入临床前、临床I和II期试验,尤其在肿瘤、中枢神经系统疾病和心血管疾病的治疗中显示出明显优势。基于细胞穿透肽的种种特性和优点,CPPs将在药学、医学诊断治疗、基础研究领域显示越来越重要的地位。细胞穿透肽作为载体搭载货物分子入胞是一个复杂的过程,尽管各种CPP功能相似,但结构、理化性质和入胞机制不尽相同。目前研究人员的观点普遍认为,CPPs穿透细胞主要存在3条比较合理的入胞机制：内吞、直接穿膜与依靠特定跨膜结构。一个CPP分子的入胞的具体机制是有赖于多个与之相关的参数,如分子大小(携带物质)、温度、细胞类型和细胞内外的环境等因素。比如富含Arg的短CPP,主要通过内吞方式进行细胞摄取。Tunnemann等曾报道了Tat肽与小肽货物融合后进入细胞是通过一种快速的、非内吞依赖直接入膜的过程,而与大的货物融合后则是通过内吞途径内化入胞；Duchardt教授等最近报道了当Antp的浓度40μmol/L时其内化机制则可能涉及包括依靠特定跨膜结构在内的多种入胞通路。基因敲除(gene knockout)是指一种遗传工程技术,是研究相关基因功能最常用的实验方法。其原理是针对某个序列已知但功能未知的序列,通过构建相关基因的缺失突变体,改变生物的遗传基因,令特定的基因功能丧失作用,从而使部分功能被屏障,并可进一步对生物体造成影响,进而推测出该基因的生物学功能。目前实现基因敲除的常用技术有Cre-LoxP系统、FLPI系统等,Cre-LoxP系统属于位点特异性重组系统,是近年来最普遍应用的一种条件性敲除基因的方法,来源于噬菌体P1,包含有两个重要的组成部分：一个是LoxP位点；另一个是识别LoxP位点的Cre重组酶。这一系统主要通过位点特异性的Cre重组酶识别34 bp的部分反转重复的LoxP序列(ATAACTTCGTATAAT GTATGCTATACGAAGTTAT),通过分子内重组将方向相同的2个LoxP位点问的序列删除。该系统1981年被首次发现,自1993年被Gu等研究人员正式作为一种基因操作手段应用以来,己广泛地应用于基因克隆、人工抗体文库的构建、抗体重排和类型转换等动物模型和嵌合基因组等研究领域并体现出巨大优势,并且该系统已经成功用于多种真核细胞和细菌如谷氨酸棒状杆菌、炭疽杆菌、植物乳杆菌的基因敲除。Cre-LoxP系统可促进对未知基因功能的研究。利用脂质体的方式外源结合Cre重组酶转染细胞沉默特定基因近年来已经有相关的报道,但是该方式存在着操作复杂、费用昂贵、沉默效果不明显的缺点,同时难以实现在体水平的基因敲除以及组织靶向敲除的目的。而CPPs不仅具有穿膜快速、直接、细胞毒副作用小和作用显著等优点,还能实现搭载货物分子的体内运输,并且能够通过修饰获得靶向定位能力。核定位序列(Nuclear localization signal, NLS)是蛋白质的一个结构域,为另一形式的信号肽。通常为4-8个氨基酸,它能与入核载体相互作用,使蛋白能被运进细胞核。第一个被确定的NLS序列的蛋白质是SV40 (Simian vacuolating virus 40)的T抗原(92kDa),也是研究的最成熟的核定位信号。NLS的特点：(1)核心NLS由含4个赖氨酸或者精氨酸的六肽构成；(2)不含酸性氨基酸和大分子的氨基酸；(3)核心NLS的旁侧为脯氨酸或甘氨酸；(4)旁侧顺序中部存在疏水氨基酸以保证NLS位于蛋白质的分子表面。借助这一特殊的信号肽,可以提高CPPs向细胞核内转运Cre重组酶的效率。本研究旨在对实验室前期筛选出的152条CPPs多肽基础上,进行进一步的研究：(1)比较上述多肽内化MEF细胞的效率,筛选对MEF细胞内化能力较高的多肽；(2)利用荧光强度定量比较,建立起内化多肽能力的评价方法；(3)选择内化MEF细胞能力较高的多肽,与连接重组酶Cre以及NLS构建原核融合蛋白表达载体；(4)利用融合蛋白His-SBP-Tat-NLS-Cre-EGFP内化Cdc42基因两端带有LoxP位点的小鼠腹腔巨噬细胞,蛋白水平去评价该系统敲除目的基因的效果。基于以上研究背景,在具体的研究工作中我采用如下的研究方法如通过克隆质粒构建、原核表达纯化融合蛋白、EGFP进行示踪、荧光强度比较效率；利用含绿色荧光蛋白标签的办法纯化蛋白二次筛选验证多肽内化强度；利用M5对选取的5个代表性多肽进行内化效率的比较；利用生物信息学的方法进行多肽理化性质与内化关联的分析；Cdc42基因两端带LoxP位点的C57小鼠腹腔巨噬细胞的分离使用外源添加PBS作刺激物的方法诱导分离得到Cdc42基因两端带LoxP位点的C57小鼠腹腔巨噬细胞；利用蛋白免疫印迹方法在蛋白水平检测基因敲除效果。通过以上实验研究,我们得到以下结果：(1)从实验室前期筛选出的152条CPPs多肽基础上,得到强内化多肽17条,弱内化多肽12条,几乎不内化的多肽123条；(2)通过荧光强度定量的方法完成了验证后的五个强内化多肽内化MEF细胞内化效率的比较；(3)通过对强内化多肽的电荷数、分子量、亲水疏水性质和氨基酸的种类多角度分析发现：内化后特征为颗粒状的不论是强内化多肽还是弱内化多肽净电荷全部为正电荷或零电荷；强内化多肽亲水系数为-2.286-2.7,强内化较多肽等电点分布3.49-12.00；强内化多肽普遍多含碱性氨基酸,且性质偏亲水性；(4)成功构建以下重组质粒载体：pET14b-SBP-Tat-NLS-Cre-EGFP、pET14b-ARE-NLS-Cre-EGFP、pET14b-HDG-NLS-Cre-EGFP、pET14b-HPT-NLS-Cre-EGFP和pET14b-TVL-NLS-Cre-EGFP;(5)成功分离得到Cdc42基因两端带LoxP位点的C57小鼠腹腔巨噬细胞;(6)融合蛋白His-SBP-Tat-NLS-Cre-EGFP内化Cdc42基因两端带LoxP位点的C57小鼠腹腔巨噬细胞成功敲除了目的基因。综上所述,本论文首先验证了实验室前期筛选出的152条CPPs对MEF细胞的内化能力；然后利用生物信息学的方法预测了多肽的理化性质,分析挖掘了内化能力和多肽理化性质之间的关联；同时挑选出强内化能力的5个多肽,利用M5在MEF细胞系进行内化效率比较；其次成功构建了含NLS-Cre-Tat的重组原核质粒,体外表达纯化外源蛋白充当基因敲除的载体,实现在细胞水平上对目的基因的敲除。上述工作为组织或动物水平的基因敲除技术做出了有益的探索,也拓宽了CPPs未来在基因操作和治疗中的应用前景。
【关键词】：穿透肽 内化 核定位信号 Cre重组酶 基因敲除
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3411
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 第一章 前言15-20
• 第二章 材料与方法20-31
• 2.1 主要实验试剂20-21
• 2.2 质粒、菌株21
• 2.3 主要试剂配制21-23
• 2.4 主要仪器23-24
• 2.5 方法24-31
• 第三章 结果31-43
• 3.1 多肽内化MEF细胞31-34
• 3.2 生物信息学分析34-37
• 3.3 BCA法蛋白定量结果37
• 3.4 多肽内化MEF细胞比较37-38
• 3.5 代表性多肽的原核表达和纯化38-39
• 3.6 重组原核表达载体的鉴定39-40
• 3.7 His-SBP-Tat-NLS-Cre-EGFP原核表达及纯化40
• 3.8 Cdc42基因两端带LoxP位点C57小鼠腹腔巨噬细胞的分离40-41
• 3.9 融合蛋白转导C57小鼠腹腔巨噬细胞效率的观察41-42
• 3.10 融合蛋白内化细胞敲除基因的效果检测42-43
• 第四章 讨论43-50
• 4.1 多肽的内化筛选优化及内化能力影响因子的分析43-47
• 4.2 基因敲除技术的发展与应用47-48
• 4.3 CPP与Cre-LoxP系统的结合48-50
• 第五章 全文小结50-51
• 参考文献51-55
• 在读硕士期间发表的文章55-56
• 英文缩略词表56-58
• 致谢58-59

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