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胞外HSP60上调心肌TLR2和TLR4受体表达的研究

发布时间:2017-05-01 12:01

  本文关键词:胞外HSP60上调心肌TLR2和TLR4受体表达的研究,由笔耕文化传播整理发布。


【摘要】:Toll样受体(toll-like receptors, TLRs)是免疫细胞识别病原体分子的一类重要受体,也在心肌细胞、血管内皮细胞、神经元等多种细胞表达,参与细胞应激和炎症反应等生理病理过程。已被克隆的人类TLRs有11种亚型,被报道在鼠类心肌细胞表达的包括TLR2/3/4/5/7/9亚型。HSP60(heat shock protein60)是HSPs家族的成员之一,生理状态下主要位于线粒体内(约70-80%),小部分位于胞浆。文献报道,外源性HSP60(胞外HSP60)能够激活巨噬细胞和成纤维细胞的TLR2和TLR4受体,导致肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白介素(interleukin,IL)等致炎因子产生,但胞外HSP60是否影响TLR2和TLR4受体表达未见报道。我们前期报道,在心肌缺血大鼠模型,HSP60异常出现在血清中,即出现胞外HSP60(Lin et al,AJP,2007;293: H2238-47)。我们预实验发现,在培养的大鼠H9c2心肌细胞系,外源性HSP60能够上调TLR2和TLR4表达,而缺血心肌TLR2和TLR4表达也上调。因此,我们推测,心肌缺血时,异常出现在血液中的HSP60(胞外HSP60)很可能不仅作为配体激活心肌细胞的TLR2和/或TLR4,而且能够上调心肌表达TLR2和TLR4。为证明这一假设,本课题在正常培养的H9c2心肌细胞,研究了外源性HSP60上调TLR2/4表达的作用及信号机制;并且,在H9c2心肌细胞模拟缺血模型和整体大鼠心肌缺血模型,研究了内源性胞外HSP60上调TLR2/4表达的作用及信号机制。 研究方法 在大鼠H9c2心肌细胞模型中,给予外源性HSP60或模拟缺血(无血清+低糖+1%低氧),ELISA法检测培液上清HSP60含量检测模拟缺血是否引起HSP60出胞;通过real-time PCR和Western blot法检测TLR2/4表达;通过特异性阻断HSP60信号通路中的主要信号分子“TLR4、MyD88、p38、JNK和NF-κB”,研究HSP60上调TLR2/4表达的信号机制。 在整体大鼠心肌缺血模型中,结扎冠状动脉左前降支(LAD)造成心肌缺血以及静脉注射HSP60抗体来中和封闭血浆中的HSP60后,通过real-time PCR和Western blot法检测心肌TLR2/4表达;ELISA法和Western blot法检测血浆HSP60。 研究结果 1.在培养的大鼠H9c2心肌细胞系,外源性HSP60通过TLR4-MyD88-JNK/NFκB信号通路介导上调TLR2和TLR4表达:外源性HSP601μg/mL使得TLR2和TLR4mRNA水平和蛋白表达量均显著上调;特异性阻断HSP60信号通路中的主要信号分子“TLR4、MyD88、p38、JNK和NF-κB”结果表明,TLR4siRNA、MyD88抑制性多肽(Inhi MyD88)、JNK抑制剂SP600125、NF-κB抑制剂PDTC四种干预能够显著抑制外源性HSP60引起的TLR2和TLR4表达上调,而TLR2siRNA和p38抑制剂SB203580无显著效应,表明HSP60上调TLR2/4表达的效应由TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路所介导。TLR4siRNA不仅抑制TLR4表达,而且显著抑制HSP60引起的TLR2/4上调,TLR2siRNA仅仅抑制TLR2表达,不影响HSP60引起的TLR2/4上调。 2.在模拟缺血培养的大鼠H9c2心肌细胞,HSP60出现在胞外,并且经TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路参与介导模拟缺血所致TLR2和TLR4表达上调:在培养的大鼠H9c2心肌细胞,模拟缺血引起培液上清中出现HSP60,即HSP60出现在胞外;同时,模拟缺血引起TLR2/4表达上调,用抗体特异性封闭胞外HSP60或者阻断信号分子TLR4、 MyD88、 JNK和NF-κB能够显著抑制该效应,表明“胞外HSP60-TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路”参与介导模拟缺血所致TLR2/4表达上调。 3.在整体大鼠心肌缺血模型,HSP60异常出现在血浆中,并且参与介导缺血所致心肌TLR2和TLR4表达上调:在冠状动脉左前降支(LAD)结扎所致大鼠急性心肌缺血模型,我们用Western blot和ELISA法均检测到LAD结扎4h后血清中出现HSP60,而假手术组(sham)基本检测不到,表明心肌缺血引起HSP60异常出现在胞外; LAD结扎后4h,Western blot法检测到左室前壁、左室后壁、右室以及室间隔中TLR2和TLR4受体表达水平均显著高于假手术组(sham),表明LAD结扎后,全心脏TLR2和TLR4表达上调;用HSP60抗体中和血清中的HSP60,观察到能够显著抑制心肌缺血引起的TLR2和TLR4表达上调,而对照抗体IgG没有抑制效应,表明胞外HSP60参与介导心肌缺血所致TLR2/4表达上调。 结论 1.在培养的大鼠H9c2心肌细胞系,外源性HSP60上调TLR2和TLR4表达,该效应由TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路所介导。 2.在模拟缺血培养的大鼠H9c2心肌细胞, HSP60出现在胞外,并且经TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路参与介导模拟缺血所致TLR2和TLR4表达上调。 3.在整体大鼠心肌缺血模型,HSP60异常出现在血浆中,并且参与介导缺血所致心肌TLR2和TLR4表达上调。 上述研究表明,心肌缺血时HSP60异常出现在胞外,,胞外HSP60通过TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路使得心肌细胞TLR2/4表达上调,该作用是缺血心肌TLR2/4表达上调的机制之一。
【关键词】:TLR-2/4 HSP60 心肌缺血 TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路
【学位授予单位】:宁夏医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R363
【目录】:
  • 摘要4-7
  • ABSTRACT7-10
  • 英文缩写及英汉全称10-12
  • 前言12-15
  • 材料与方法15-35
  • 2.1 实验材料15-17
  • 2.1.1 细胞15
  • 2.1.2 动物15
  • 2.1.3 主要试剂15-17
  • 2.2 主要实验仪器17-18
  • 2.3 主要溶液配制18-22
  • 2.4 大鼠 H9c2 心肌细胞系的培养模型22-24
  • 2.5 大鼠心肌缺血模型24
  • 2.6 实时荧光定量 RT-PCR 方法24-30
  • 2.7 ELISA 法检测培养细胞上清液中以及动物血清中 HSP60 含量30-31
  • 2.8 Western blot 法检测 TLR2、TLR4、MyD88、Trif 蛋白的表达31-34
  • 2.9 数据统计34-35
  • 实验结果35-50
  • 讨论50-52
  • 结论52-53
  • 参考文献53-55
  • 综述55-66
  • 参考文献63-66
  • 致谢66-67
  • 在读期间发表论文67

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  本文关键词:胞外HSP60上调心肌TLR2和TLR4受体表达的研究,由笔耕文化传播整理发布。



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