hTERT靶向性amiRNA的筛选及其在scrAAV中的表达优化研究
发布时间：2021-09-07 15:03
研究背景：作为一种高效的基因调控手段，RNA干扰具有靶点专一、用量小等优点，被广泛应用于基因治疗等领域。传统的短发夹RNA载体虽然解决了常规小RNA短时效的缺点，但却伴随严重的细胞毒作用。基于內源microRNA的新一代人工microRNA载体（amiRNA）可以很好解决载体安全性问题，表达效率却不尽如人意。如何提高amiRNA载体的表达效率是目前小RNA载体急需解决的问题，amiRNA载体的优化工作对推动RNA干扰研究及其基因药物的发展意义重大。研究目的：本论文的主要目的是解决目前amiRNA载体表达中存在的瓶颈问题，获得高表达效率的新型amiRNA载体，加速小RNA基因药物的临床应用。研究方法：（1）利用Block-iT RNAi Designer软件设计靶向人端粒酶逆转录酶基因的amiRNA序列；（2）通过荧光定量、Western-Blot、Telochaser、细胞增殖、迁移、凋亡、血管生成、移植瘤实验来分析amiRNA的沉默效应和抗肿瘤活性；（3）借助报告基因沉默实验和基因芯片技术分析amiRNA的特异性和安全性；（4）依据miRNA引导序列的长度、指纹图谱、自由能等特征值差...
【文章来源】：华侨大学福建省
【文章页数】：123 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
RNAi通路简图
在胞内的内源性表达[42]。之后不久，Chung 等人发现以鼠 miR-155 原始转录本（pri-mmu-miR-155）为小 RNA 表达框的小 RNA 表达载体同样可以实现目的小RNA 的长效、安全、可控的表达[43]。鉴于这两种载体在安全性和可控性方面优于第一代小 RNA 表达载体，人们将以內源 miRNA 原始转录本为小 RNA 表达框的小 RNA 表达载体称为 amiRNA 载体，又称为第二代小 RNA 表达载体。以 pri-hsa-miR-30a 和 pri-mmu-miR-155 为小 RNA 表达框的 amiRNA 载体是目前已被广泛认可且商品化的两种 amiRNA 载体，虽然在安全性上实现了对第一代小 RNA 表达载体的突破，但对目的 siRNA 的表达却不够高效[5-7]。后续也有学者尝试进行以其它內源 miRNA 原始转录本为小 RNA 表达框的 amiRNA 载体研究，但其表达效率未能实现对这两种商品化 amiRNA 载体的超越[7, 44-48]。由于表达不够高效，人们不得不通过加大剂量来弥补自身表达的不足，这必然导致高剂量带来的潜在副作用和成本问题[49]。研究表明，现有 amiRNA 载体表达不高效的主要原因是 amiRNA 载体中所采用的表达框不能高效地加工出目的小 RNA[8]。
1.2.2 腺相关病毒RNAi 载体化表达中形成的 shRNA 载体或 amiRNA 载体同样需要借助一定的投递介质才能进入细胞内，常用的介质有化学型介质和病毒型介质两种。病毒型载体具有转染效率高、宿主范围广、时效长等优点，是小 RNA 载体化表达和基因治疗的主流运载工具，占基因治疗临床试验的 72.4-82.0%（图 1.3）。目前已经很多基因药物进入临床试验，但却只有一个获得批准，其原因除了跟选择的基因有关外，跟使用的载体也密切相关。载体本身的安全性也是阻碍其成功上市的重要原因，如腺病毒的自主复制能力、逆转录病毒的基因整合能力等都会给基因治疗带来潜在的威胁。而其中的腺相关病毒（Adenoassociated virus,AAV）由于具有良好的安全性，日益受到人们的重视。第一个基因药物 Glybera的诞生除了其治疗基因的有效性外，还有一个重要原因就是其所使用 AAV 这个基 因 载 体 的 安 全 性 。（http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/medicines/human/medicines/002145/smops/Positive/human_smop_000235.jsp&mid=WC0b01ac058001d127）。
本文编号：3389756
【文章来源】：华侨大学福建省
【文章页数】：123 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
RNAi通路简图
在胞内的内源性表达[42]。之后不久，Chung 等人发现以鼠 miR-155 原始转录本（pri-mmu-miR-155）为小 RNA 表达框的小 RNA 表达载体同样可以实现目的小RNA 的长效、安全、可控的表达[43]。鉴于这两种载体在安全性和可控性方面优于第一代小 RNA 表达载体，人们将以內源 miRNA 原始转录本为小 RNA 表达框的小 RNA 表达载体称为 amiRNA 载体，又称为第二代小 RNA 表达载体。以 pri-hsa-miR-30a 和 pri-mmu-miR-155 为小 RNA 表达框的 amiRNA 载体是目前已被广泛认可且商品化的两种 amiRNA 载体，虽然在安全性上实现了对第一代小 RNA 表达载体的突破，但对目的 siRNA 的表达却不够高效[5-7]。后续也有学者尝试进行以其它內源 miRNA 原始转录本为小 RNA 表达框的 amiRNA 载体研究，但其表达效率未能实现对这两种商品化 amiRNA 载体的超越[7, 44-48]。由于表达不够高效，人们不得不通过加大剂量来弥补自身表达的不足，这必然导致高剂量带来的潜在副作用和成本问题[49]。研究表明，现有 amiRNA 载体表达不高效的主要原因是 amiRNA 载体中所采用的表达框不能高效地加工出目的小 RNA[8]。
1.2.2 腺相关病毒RNAi 载体化表达中形成的 shRNA 载体或 amiRNA 载体同样需要借助一定的投递介质才能进入细胞内，常用的介质有化学型介质和病毒型介质两种。病毒型载体具有转染效率高、宿主范围广、时效长等优点，是小 RNA 载体化表达和基因治疗的主流运载工具，占基因治疗临床试验的 72.4-82.0%（图 1.3）。目前已经很多基因药物进入临床试验，但却只有一个获得批准，其原因除了跟选择的基因有关外，跟使用的载体也密切相关。载体本身的安全性也是阻碍其成功上市的重要原因，如腺病毒的自主复制能力、逆转录病毒的基因整合能力等都会给基因治疗带来潜在的威胁。而其中的腺相关病毒（Adenoassociated virus,AAV）由于具有良好的安全性，日益受到人们的重视。第一个基因药物 Glybera的诞生除了其治疗基因的有效性外，还有一个重要原因就是其所使用 AAV 这个基 因 载 体 的 安 全 性 。（http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/medicines/human/medicines/002145/smops/Positive/human_smop_000235.jsp&mid=WC0b01ac058001d127）。
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