结核分枝杆菌BSL-3实验室微环境表面污染检测及消毒的研究

发布时间：2017-05-02 02:00

  本文关键词：结核分枝杆菌BSL-3实验室微环境表面污染检测及消毒的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在传染性疾病的诊断和研究过程中,工作人员需要暴露于传染性病原微生物,那么极容易造成实验室感染事件(laboratory acquired infection),从而对工作人员造成职业伤害。结核病是十分严重的人类传染性疾病,其对人类健康、公共卫生及社会经济造成了严重的危害。造成结核病发病严重程度与其传播途径有关,结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, M.tb,生物危害2类)通过空气中的气溶胶进行传播,容易造成人群的感染和传播,其相关实验操作需要在BSL-3实验室内进行。目前,在结核病人的诊治以及对抗结核病疫苗及药物的研究过程中,都需要进行分离并培养结核分枝杆菌,实验操作人员需要直接与细菌接触。文献报道,实验人员在进行结核分枝杆菌操作过程中引起的实验室获得性感染发生几率较其他病原微生物高。为了降低结核分枝杆菌实验人员获得性感染的发生几率,必须严格控制实验操作过程中的的生物安全。然而,明确实验过程中结核分枝杆菌在BSL-3实验室内微环境中产生的污染程度,并及时对污染环节进行控制,对污染部位进行消毒,是确保实验室生物安全的基础,对控制实验室感染的发生具有重要意义。本论文研究内容分为三个部分。首先,在前期研究结果的基础上,针对结核分枝杆菌基因组DNA差异性区域(Region of diference),建立BSL-3实验室微环境表面污染监测的qPCR检测方法,包括SYBR Green、TaqMan和qRT-PCR等方法,确立了qPCR检测的多重检测指标。通过识别M.tb感染动物模型建立实验活动中BSL-3实验室微环境表面污染的关键部位及环节,利用已建立监测技术进行检测,基于检测结果为实验人员提出建议和防护措施,从而降低实验人员实验室获得性感染的风险。最后,研究了过氧化氢干雾生物安全柜微环境表面的消毒效果,通过清除污染有效控制实验室获得性M.tb感染的发生,从而保障BSL-3实验室生物安全。论文的第一部分研究,在前期研究结果的基础上,建立了结核分枝杆菌BSL-3实验室微环境表面污染监测的qPCR检测方法[13-21]。首先,通过生物信息学方法对M.tb基因组DNA与BCG和M.S基因组DNA进行比对,针对差异区域RD1、RD4、RD9、RD10和RD12分别设计特异性引物。然后进行扩增反应特异性验证(PCR和qPCR),最终确定RD9区为特异性检测靶点。反应特异性及检测敏感性验证显示,RD9区引物能够检测到结核分枝杆菌模板DNA最低拷贝数为101/μL。然后,为了在微环境表面污染的检测中进一步精确qPCR的检测结果,针对RD9区检测靶点构建了标准品,标准品最低检测拷贝数为101。进而,在qPCR (SYBR Green)检测方法的基础上,在RD9区检测区域构建了特异性TaqMan探针(probe A),最低能够检测M.tb基因组DNA拷贝数为102/μL。为了进一步确定实验室微环境污染M.tb的活性,初步摸索了qRT-PCR的检测方法,最低可检测到M.tb RNA拷贝数为104/gL。最后,研究了污染样品中DNA的定量与活菌量(CFU值)之间的关系。应用已建立的RD9区的PCR和qPCR检测方法,对BSL-3实验室微环境表面在开展实验之前的污染情况进行检测,结果显示尽管对实验室进行了终末消毒,但在之前实验过程中某些污染程度较大的部位,仍存在一定的M.tb DNA污染。为了减少这部分DNA对于后续实验中实验室微环境污染检测的影响,需要对生物安全柜和培养箱这些部位进行去污染处理,使用75%酒精进行擦拭从而减少污染DNA的残留。论文的第二部分检测了建立结核分枝杆菌动物模型(小鼠急性感染模型、小鼠呼吸道感染模型、豚鼠皮下注射感染模型)实验过程中关键污染环节和部位的污染风险[22-29]。采用已建立的RD9区PCR和qPCR (SYBR Green)检测技术,结合前期建立的RD2区qPCR 和 PCR检测技术,监测了建立动物感染模型过程中垫料及饲料更换、动物解剖操作以及脏器研磨等实验操作,检测了实验室微环境中动物饲养笼具、生物安全柜操作面及个人防护装备等部位的污染。检测结果提示,动物垫料及饲料更换、动物解剖操作过程中检测部位的污染程度比脏器研磨实验严重；其中饲养笼具污染最为严重的部位为鼠笼的内外侧、饮水瓶和饲料架；生物安全柜污染主要集中实验操作区；个人防护用品污染最为严重的区域是操作者左右手套手心区域。因此,提示在进行相关M.tb实验操作过程中,需要加强该类区域或部位的防护,并及时进行消毒。为了防止M.tb活菌污染引起实验室获得性感染,我们检测了Elispot检测的小鼠脾细胞、用于FACS检测的豚鼠脾细胞和用于ELISA检测的豚鼠血清中M.tb活菌残余。检测结果提示,M.tb感染小鼠和豚鼠脾细胞未经甲醛固定时,均存在M.tb活菌残余,然而经过甲醛固定后脾细胞未检测到M.tb活菌。豚鼠血清经过高速离心后,未检测到M.tb活菌。论文的第三部分研究了过氧化氢干雾(粒径小于10um)不同的消毒程序对生物安全柜表面常见微生物的消毒效果。结果显示,在生物安全柜内采用优化的消毒程序(发散循环8次,每次1分钟,达60 ppm后,静置消毒2小时。利用该程序,过氧化氢干雾可完全杀灭1×106CFU枯草杆菌芽孢、嗜热脂肪杆菌芽孢、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、耻垢分枝杆菌以及1×108 CFU大肠埃希菌。然而当金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、耻垢分枝杆菌微生物浓度达1×107CFU时,过氧化氢干雾无法完全杀灭微生物。生物安全实验室微环境消毒是控制实验室污染的重要环节。过氧化氢广泛用于病原微生物实验室微环境消毒,通过研究建议在进行过氧化氢干雾消毒,应先用消毒剂处理,以期彻底杀灭生物安全柜微环境中污染的病原微生物[30-35]。本研究建立了结核分枝杆菌BSL-3实验室微环境表面污染监测的qPCR检测方法,初步明确了感染动物实验活动中易被感染性气溶胶污染的区域,从而为个人防护及有效的消毒清场提供了依据；同时验证了过氧化氢干雾对结核分枝杆菌BSL-3实验室生物安全柜内微环境的消毒效果。从污染识别、污染控制及污染清除三个方面,有效控制实验室获得性M.tb感染的发生,为结核分枝杆菌BSL-3实验室生物安全提供保障。
【关键词】：结核分枝杆菌 BSL-3 实验室 实验室污染 微环境污染 检测 结核分枝杆菌感染 动物模型 过氧化氢干雾 消毒
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-12
• 第一部分 结核分枝杆菌BSL-3实验室微环境表面污染的检测方法的建立12-41
• 前言12-13
• 材料与方法13-26
• 结果26-38
• 一、结核分枝杆菌BSL-3实验室微环境PCR检测方法的建立26-28
• 二、结核分枝杆菌BSL-3实验室微环境定量PCR检测方法的建立28-34
• 三、结核分枝杆菌qRT-PCR检测方法的建立34-35
• 四、结核分枝杆菌BSL-3实验室实验活动前微环境污染的检测35-38
• 讨论38-41
• 第二部分 结核分枝杆菌感染动物模型建立过程中关健污染环节的研究41-70
• 前言41
• 材料与方法41-54
• 结果54-64
• 一、在BSL-3实验室建立结核分枝杆菌感染动物模型的研究54
• 二、结核分枝杆菌动物感染模型建立过程中的风险识别54-58
• 三、动物感染模型建立过程中实验室微环境污染的检测58-63
• 四、带离BSL3实验室感染动物标本的M.化活菌检测63-64
• 讨论64-70
• 第三部分 过氧化氢干雾生物安全柜微环境表面消毒效果的研究70-82
• 前言70
• 材料与方法70-73
• 结果73-79
• 一、不同程序下过氧化氢干雾杀灭芽孢效果的检测73-75
• 二、优化程序下过氧化氢干雾杀灭不同病原微生物效果的检测75-79
• 讨论79-82
• 论文总结82-83
• 参考文献83-89
• 综述89-100
• 参考文献98-100
• 附录100-101
• 致谢101-102

【二级参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 姜成春;庞素艳;马军;谢炜平;邹原;;钛盐光度法测定Fenton氧化中的过氧化氢[J];中国给水排水;2006年04期

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1 田章福;低浓度酒精/过氧化氢燃气发生器喷雾燃烧过程研究[D];国防科学技术大学;2007年

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本文编号：340027