人CD96分子胞膜外第一结构域的晶体结构和功能研究

发布时间：2017-05-02 09:07

  本文关键词：人CD96分子胞膜外第一结构域的晶体结构和功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：NK细胞,即自然杀伤细胞(natural killer cell)是人体固有免疫系统中的重要组成部分之一。当外来病原微生物抗原侵袭时,先天免疫系统可以作为机体的第一道天然防线,迅速活化并对病原体进行杀伤,该杀伤作用发生在人体获得性免疫系统启动之前,在肿瘤细胞和病毒感染的免疫反应中起着十分重要的屏障作用。NK细胞受到表达于其表面的活化性受体和抑制性受体的共同调控。近年来,对NK细胞识别肿瘤细胞的机制研究发现,其识别机制十分多样化,表达于其表面的各种受体得到了研究者的关注,尤其是一些活化性受体。 CD96(Tactile)是一个主要表达在活化的T细胞,NK细胞上的免疫受体分子。它属于免疫球蛋白超家族,胞外区有3个免疫球蛋白结构域(V1,V2/C和C)。CD96的配体是表达于肿瘤细胞上的CD155,最近的研究表明,CD96的第一个IgV结构域(CD96V1)是与CD155特异性结合的主要部位,在NK细胞粘附和NK细胞介导的杀伤肿瘤细胞的过程中起着重要的作用。 CD96分子的结构尚未解析,我们通过生物信息学对CD96分子进行分析,发现与CD96有一定同源性的分子主要有CD226,CD86,CD113和CD166,其中CD166和CD226与CD96同源性较高。研究表明,表达于NK细胞表面的受体CD226和CD96两者都参与免疫应答,都属于激活性受体,向细胞内传递活化型信号,从而引发多种免疫学效应。但是目前来说,对细胞间黏附分子相互作用的机制还在探索和研究中。我们已知CD96和CD226都是免疫球蛋白超家族中的成员,其胞膜外区具有相似的空间结构,并且CD96第一个V样结构域和CD226的V样结构域同源性为29%,CD226和CD96有共同的配体CD155,CD226的结构的解析或许能为CD96的结构解析提供一些有价值的数据作为参考,从而为揭示CD96与CD155作用的机制奠定结构基础。 本研究构建了人类CD96第一个IgV样结构域(hCD96V1)的表达载体,并将它在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以包涵体形式表达。通过包涵体体外复性,我们得到了CD96可溶性蛋白。分析超速离心结果证明CD96可溶蛋白在体外以二聚体形式存在。采用座滴气相扩散法获得了衍射质量较好的CD96蛋白晶体,衍射分辨率为1.9A,晶体属于空间群P21,晶胞参数为a=35.1,B=69.5,C=49.6A,α＝γ＝90°,β=105.4°。于此同时,我们通过CD96V1四聚体染色技术验证了CD96第一V样结构域与CD155结合的实验。并预测了CD96V1上的几个亲水性氨基酸可能与CD96二聚体的形成有关。为后续的结构和功能研究奠定了基础。
【关键词】：CD96 第一IgV结构域 细胞粘附分子 蛋白纯化 结晶
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392;R3416
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 目录6-9
• 1 文献综述9-20
• 1.1 NK细胞研究进展概述9-15
• 1.1.1 NK细胞9
• 1.1.2 NK细胞功能和活化机制9-11
• 1.1.3 NK细胞的受体11-13
• 1.1.4 NK细胞与肿瘤细胞的杀伤机制13-15
• 1.2 CD96分子的研究进展15-20
• 1.2.1 CD96的发现,及结构特征15-17
• 1.2.2 CD96同源性分子17-18
• 1.2.3 CD96的识别与活化机制的研究进展18-20
• 2 引言20-21
• 3 材料和方法21-40
• 3.1 主要试剂和仪器21-26
• 3.1.1 细胞与基因21
• 3.1.2 引物21-22
• 3.1.3 载体质粒22
• 3.1.4 仪器22-23
• 3.1.5 试剂及试剂盒23-24
• 3.1.6 溶液配制24-26
• 3.2 技术路线26-27
• 3.3 实验方法27-40
• 3.3.1 CD96V1-pET21a表达质粒的构建27-31
• 3.3.2 CD96V1结构域的小量表达分析31-32
• 3.3.3 CD96V1结构域包涵体的大量制备32
• 3.3.4 CD96V1结构域包涵体的复性32-33
• 3.3.5 CD96V1结构域蛋白的纯化33-34
• 3.3.6 CD96V1结构域蛋白的结晶34
• 3.3.7 CD96V1结构域蛋白的Sulfo-EGS交联实验34
• 3.3.8 CD96V1结构域蛋白分析超速离心34-35
• 3.3.9 CD96V1生物素化及其突变体生物素化克隆的构建35-37
• 3.3.10 CD96V1及其突变体生物素化和四聚体制备37-38
• 3.3.11 CD155真核表达载体构建38
• 3.3.12 细胞培养及表达CD155的细胞鉴定38-39
• 3.3.13 CD155-GFP转染CHO细胞39
• 3.3.14 CD96V1及其突变体的四聚体染色39-40
• 4 结果与分析40-55
• 4.1 CD96V1原核表达质粒的构建40-41
• 4.2 CD96V1结构域的小量表达分析41-42
• 4.3 CD96V1结构域蛋白的纯化42-44
• 4.4 CD96V1结构域蛋白结晶的生长44-45
• 4.5 CD96V1结构域蛋白SULFO-EGS交联实验45-46
• 4.6 CD96V1结构域蛋白分析超速离心46
• 4.7 CD96V1结构域晶体的衍射数据收集及处理46-47
• 4.8 CD96V1结构域及其突变体(生物素化)克隆的构建47-50
• 4.9 CD96V1结构域及其突变体(生物素化)四聚体蛋白的制备50-51
• 4.10 细胞培养及表达CD155的细胞鉴定51-52
• 4.11 CD155真核表达载体的构建52-53
• 4.12 CD155-GFP转染CHO细胞53
• 4.13 CHO细胞染色及流式细胞术鉴定53-55
• 5 讨论与展望55-57
• 5.1 CD96V1结构域晶体结构分析的意义55
• 5.2 CD96二聚体形成的作用力55-56
• 5.3 CD96分子的展望56-57
• 结论57-58
• 参考文献58-62
• 附录62-65
• 缩略词表62-64
• 载体图谱64-65
• 致谢65-66
• 作者简介66

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 William H.D.Hallett;William J.Murphy;;Natural Killer Cells:Biology and Clinical Use in Cancer Therapy[J];Cellular & Molecular Immunology;2004年01期

中国博士学位论文全文数据库 前2条

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2 谢薇;骨髓增生异常综合征发病机制的探索性研究[D];华中科技大学;2010年

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本文编号：340652