脂肪基质细胞诱导分化为星形胶质细胞过程中线粒体凋亡与自噬的关系

发布时间：2017-05-02 09:19

  本文关键词：脂肪基质细胞诱导分化为星形胶质细胞过程中线粒体凋亡与自噬的关系，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的探讨在ADSCs诱导分化为星形胶质细胞过程中线粒体凋亡与自噬的关系，从而为进一步增加获得的ADSCs源性星形胶质细胞数量并延长其存活时间具有重要的科学意义。 方法1参照叶长青等的实验方法，将成人脂肪组织体外分离、培养为ADSCs，倒置相差显微镜下每日观察ADSCs的形态学变化。2将传至第3代的成人ADSCs，应用以含IBMX为主要成分的诱导剂诱导其向星形胶质细胞分化，按照诱导时间的不同分为诱导48h、7d、14d、21d组，并在倒置相差显微镜下观察诱导后细胞形态学的变化。3应用免疫细胞化学法和Western-blotting分别检测未诱导的ADSCs及诱导分化48h、7d、14d、21d的星形胶质细胞特异性标志蛋白胶质纤维酸性蛋白（Glial fbrillary acidic protein, GFAP），，Bcl-2蛋白家族蛋白Bcl-2、Bax及细胞色素C（Cytochrome C）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3（Cysteine aspartate specificprotease-3）及微管相关蛋白轻链3（Microtubule-associated protein light chain3,LC3）的表达。4流式细胞术Annexin/PI双染法检测未诱导的ADSCs及诱导后48h、7d、14d、21d时细胞的生存状态。5透射电子显微镜下观察诱导后14d的星形胶质细胞线粒体超微结构、凋亡及自噬现象。6MTT法检测ADSCs诱导分化为星形胶质细胞过程中细胞的生长状态。7统计学方法：所得实验数据应用Excel2003数据库整理，采用统计软件包SPSS17.0进行分析，数据均以（x s）表示，不同时间点间的比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。 结果1提取的原代ADSCs于24h时已贴壁，倒置相差显微镜下可见细胞呈三角形、短梭形。培养至7~10d时可见大量呈漩涡状排列的长梭形细胞。2诱导反应48h时，细胞折光性增强，部分细胞的胞体周围伸出细长突起，并有多个分支。诱导反应7d时，细胞胞体折光性显著增强，部分细胞呈现典型的星形胶质细胞形态，并交织成网状。诱导14d时，细胞胞体折光性较7d时更加增强，但细胞形态与7d时无明显变化。诱导21d时，细胞数量减少，细胞的突起较诱导14d时变短、变少。3免疫细胞化学结果显示GFAP在未诱导的ADSCs中无阳性表达，而在诱导后各时间点均可见阳性表达细胞，且在细胞体和突起部位的细胞质均呈阳性表达，GFAP的细胞阳性表达率仅7d与14d无统计学差异（P＞0.05），至诱导7d时GFAP的阳性表达率达到高峰（P＜0.05）。Bax、Bcl-2、Cyt-c、Caspase-3和LC3在未诱导的ADSCs和诱导反应的各时间点均可见阳性表达，而且阳性表达部位主要位于细胞核周围的细胞浆，而突起部位没有见到明显的阳性表达。Bcl-2的阳性表达率随着诱导时间的延长逐渐降低（P＜0.05），在未诱导的ADSCs和诱导后各时间点仅7d与14d无统计学差异（P＞0.05）。Bax、Cyt-c、Caspase-3、LC3的阳性表达率在未诱导的ADSCs和诱导后48h、7d、14d、21d之间均有明显统计学差异（P均＜0.01），至诱导14d时Bax、Cyt-c、Caspase-3、LC3的阳性表达率均达到高峰（P均＜0.05）。4Western-blotting结果显示，GFAP在未诱导组的ADSCs中无表达，随诱导时间的延长其表达量增加，至7d时达到高峰（P＜0.05）。Bcl-2的表达水平随着诱导时间的延长逐渐降低（P＜0.05）。LC3Ⅰ的表达随诱导时间的延长，逐渐降低（P＜0.05）。Bax、Cyt-c、Caspase-3及LC3Ⅱ的表达水平均逐渐增加，至诱导14d达到高峰（P均＜0.05）。5透射电子显微镜下可见到线粒体的超微结构，凋亡小体结构及自噬现象。6流式细胞术的检测结果显示，诱导反应过程中的细胞存活率随着诱导时间的延长逐渐下降，早期凋亡率、晚期凋亡或坏死率随着诱导时间的延长逐渐升高。7MTT的结果显示，随着诱导时间的延长，细胞的存活数量逐渐下降。 结论1ADSCs在应用以IBMX为主要成分的诱导剂诱导分化为星形胶质细胞的第7~14d时处于最佳的存活和分化状态，此时可以终止反应，并对于所得的细胞进行筛选分离和保存，以便于进行相关的应用和研究。2在正常ADSCs中，经线粒体信号传导途径产生的凋亡和自噬反应较弱。3在ADSCs诱导分化为星形胶质细胞的过程中，线粒体凋亡和细胞自噬反应明显增强，但自噬反应不足以清除全部受损的线粒体，从而引发线粒体途径介导的细胞凋亡。
【关键词】：脂肪基质细胞 诱导分化 星形胶质细胞 线粒体凋亡 自噬
【学位授予单位】：河北联合大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-13
• 第1章 实验研究13-45
• 1.1 材料与方法13-23
• 1.1.1 材料13-17
• 1.1.2 实验方法17-23
• 1.2 结果23-37
• 1.2.1 成人 ADSCs 原代及传代培养的细胞的形态学特征23-24
• 1.2.2 GFAP/Bax/Bcl-2/Cyt-c/Caspase3/LC3 的免疫细胞化学检测结果24-30
• 1.2.3 GFAP/Bax/Bcl-2/Cyt-c/Caspase3/LC3 的 Western-blotting 结果30-32
• 1.2.4 线粒体超微结构及凋亡与自噬的变化特征32-35
• 1.2.5 细胞生存状态的流式细胞术检测结果35-36
• 1.2.6 细胞生长状态的 MTT 法检测结果36-37
• 1.3 讨论37-40
• 1.4 结论40-41
• 参考文献41-45
• 第2章 综述 自噬与线粒体自噬45-53
• 2.1 自噬的简介及发生过程45-46
• 2.2 自噬的分子机制及其调节46-47
• 2.3 线粒体自噬47-49
• 2.3.1 线粒体的动态变化47-48
• 2.3.2 线粒体自噬的途径48
• 2.3.3 PINK1/Parkin 介导的线粒体大自噬途径48
• 2.3.4 Nix 介导的线粒体大自噬途径48-49
• 2.4 线粒体自噬与疾病49-50
• 参考文献50-53
• 致谢53-55
• 导师简介55-56
• 作者简介56-57
• 学位论文数据集57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 ;Ultrastructure of neuronal-like cells differentiated from adult adipose-derived stromal cells[J];Neural Regeneration Research;2010年19期

2 ;A novel ethanol-based method to induce differentiation of adipose-derived stromal cells into astrocytes[J];Neural Regeneration Research;2011年10期

3 欧亚;元小冬;蔡亚楠;陆艳卉;;ADSC源性神经干细胞向神经元和星形胶质细胞不同方向分化时的超微结构变化研究[J];中国病理生理杂志;2011年07期

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本文编号：340705