滤泡辅助性T细胞在口蹄疫重组腺病毒疫苗免疫应答中的作用研究

发布时间：2017-05-02 15:16

  本文关键词：滤泡辅助性T细胞在口蹄疫重组腺病毒疫苗免疫应答中的作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：滤泡辅助性T细胞(Follicular T Helper cells，Tfh细胞)是一类全新的T细胞亚群，Tfh细胞在B细胞的发育、生发中心的形成、抗体类别转换，建立长期体液免疫应答等过程中扮演主要角色。本研究利用表达口蹄疫病毒VP1基因的重组腺病毒疫苗(rAd5VP1)免疫小鼠，通过观察小鼠脾脏中滤泡辅助性T细胞(T follicular helper cells，Tfh)的分化、生发中心（GC）的形成、Tfh细胞转录因子BCL-6mRNA的表示水平及Tfh细胞主要细胞因子白细胞介素-21(interleukin-21，IL-21)的分泌水平，探讨Tfh细胞在口蹄疫重组腺病毒疫苗免疫应答中所发挥的作用。 方法：6周龄BALB/c小鼠，随机分为两组，每组10只。实验组免疫rAd5VP1，对照组注射PBS。 1.免疫后7d，取小鼠脾脏，分离单个核细胞，通过流式细胞术(FCM)检测Tfh细胞（CD4~+CXCR5~+PD-1~+）的分化、生发中心B细胞（B220+GL-7+）的分化；分析CXCR5~+T细胞/CD4~+T细胞的比例、CXCR5~+PD-1~+T细胞/CD4~+T细胞的比例、GL-7+B细胞/B220+B细胞的比例。 2.免疫后7d，取小鼠脾脏，分离单个核细胞，通过real-time RT-PCR技术检测Tfh细胞转录因子BCL-6mRNA的表达水平。 3.免疫后7d，取小鼠脾脏，常规方法制作石蜡切片，经FITC-花生凝集素（PeanutAgglutinin, PNA）染色，免疫荧光显微镜观察生发中心的形成。 4.免疫后7d，分离血清，采用酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒检测小鼠血清中Tfh细胞分泌细胞因子IL-21的表达水平。 结果： 1.重组腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠，7d后，流式细胞术检测结果显示，重组腺病毒疫苗rAd5VP1能诱导小鼠Tfh细胞的分化，而且，单个核细胞中CXCR5~+T细胞/CD4~+T细胞的比例(4.05±0.10)明显高于PBS对照组（2.14±0.29），P=0.007.**P 0.01；单个核细胞中CXCR5~+PD-1~+T细胞/CD4~+T细胞的比例(1.17±0.17)明显高于PBS对照组(0.69±0.17)，P=0.03.*P 0.05； 2.重组腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠，7d后，流式细胞术检测结果显示，单个核细胞中GL-7+B细胞/B220+B细胞的比例(3.66±0.53)明显高于PBS对照组(1.74±0.05)，P=0.02.*P 0.05; 3.重组腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠，7d后，real-time RT-PCR检测BCL-6mRNA的相对表达水平得到CT值，进行相对定量处理得到2 ΔΔCT值，再行统计分析得到疫苗rAd5VP1免疫组中BCL-6mRNA表达量是对照组表达量的2.39倍。P=0.001.**P 0.01。 4.重组腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠，7d后，分离血清，ELISA试剂盒检测血清中IL-21分泌水平，结果显示，rAd5VP1实验组中IL-21表达量（63.68±13.15，pg/ml）明显高于PBS对照组表达量(4.65±2.36，pg/ml)，P=0.02.*P 0.05。 5.重组腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠，7d后，常规方法制作石蜡切片，经FITC-PNA染色，免疫荧光显微镜观察生发中心的形成。结果显示，重组腺病毒疫苗rAd5VP1能诱导生发中心的形成，经Image J软件分析平均荧光密度数值，统计得出，rAd5VP1组表达量（12.54±1.77）明显高于PBS对照组表达量PBS （6.71±0.55），P=0.00001.**P0.01。 结论：利用口蹄疫重组腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠，7d后，重组腺病毒疫苗能诱导Tfh细胞的分化、促进GC的形成及促进GC B细胞的分化、提高Tfh细胞转录因子BCL-6mRNA的表示水平，及增强Tfh细胞主要细胞因子IL-21的分泌水平。结果显示，在口蹄疫重组腺病毒疫苗诱导小鼠免疫应答中，Tfh细胞及其效应分子都起到了非常重要的作用，为进一步优化疫苗设计策略及维持长期体液免疫应答的研究提供了理论基础。
【关键词】：Tfh细胞 重组腺病毒疫苗 BCL-6 白细胞介素-21 生发中心
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 缩略语/符号说明9-13
• 前言13-19
• 研究背景17-18
• 研究目的18-19
• 材料与方法19-43
• 1.研究对象19-31
• 1.1 实验动物19
• 1.2 主要仪器和试剂19-21
• 1.2.1 主要仪器19-20
• 1.2.2 主要试剂20-21
• 1.3 口蹄疫重组腺病毒的准备21-24
• 1.3.1 细胞培养21
• 1.3.2 细胞传代21-22
• 1.3.3 重组腺病毒的扩增22
• 1.3.4 病毒滴度的测定22-24
• 1.4 小鼠免疫试验（BALB/c 小鼠，来源宁夏医科大学动物实验中心）24
• 1.5 小鼠免疫 7d 后，观察如下试验指标24-26
• 1.5.1 小鼠脾脏分离、眼球采血24
• 1.5.2 单个核细胞的分离24
• 1.5.3 FCM 检测 Tfh、B 细胞24-25
• 1.5.4 石蜡切片的制备及免疫荧光显微技术观察生发中心的形成25-26
• 1.6 mRNA 的提取步骤：均在冰上转移细胞26-27
• 1.7 mRNA 跑电泳步骤27
• 1.8 反转录成 cDNA 步骤27
• 1.9 普通 PCR 步骤27-28
• 1.10 做荧光定量 real-time RT-PCR 步骤28-29
• 1.11 ELISA 操作29-30
• 1.12 统计学处理30-31
• 2 结果31-37
• 2.1 FCM 检测 CXCR5+CD4+T 细胞结果31-32
• 2.2 FCM 检测 CXCR5+CD4+PD-1+T 细胞结果32
• 2.3 FCM 检测 B220+GL-7+B 细胞结果32-33
• 2.4 免疫荧光显微技术 FITC-PNA 染色 100X 显微镜下观察结果33-34
• 2.5 提取的 mRNA 电泳图34-35
• 2.6 普通 PCR 摸索退火温度结果35
• 2.7 real-time RT-PCR 实验结果35
• 2.8 ELISA 实验结果35-37
• 3.讨论37-42
• 4.小结42-43
• 结论43-44
• 参考文献44-51
• 文献综述51-60
• 参考文献56-60
• 致谢60-61
• 发表论文和参加科研情况61

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本文编号：341211