黄连素体外诱导人脐带间充质干细胞向神经样细胞分化

发布时间：2017-05-03 06:01

  本文关键词：黄连素体外诱导人脐带间充质干细胞向神经样细胞分化，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：对分离培养的人脐带间充质干细胞（human umbilical cordmesenchymal stem cells, hUMSCs）生物学特性进行鉴定，探讨黄连素在体外定向诱导hUMSCs向神经细胞分化中的作用和条件，为定向诱导hUMSCs向神经分化以及在临床上的应用提供理论支持和实验基础。 方法：取足月剖宫产健康新生儿脐带，用D-Hank’s充分冲洗，剔除脐动脉、脐静脉，将所剩的脐带间质组织用组织剪切成1mm3大小的组织块，0.2%胶原酶Ⅱ消化，在含20%胎牛血清（FBS）、2ng/ml表皮细胞生长因子（EGF）、25mM左旋谷氨酰胺（L-Glu）、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM/F12中培养。观察提取的原代细胞的生长状况，当细胞融合至80％～90％密度时，加入0.25%胰酶-1mM EDTA进行消化，并传代。 采用流式细胞术对首次消化后收集的细胞表型进行检测，，包括CD11b、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105和组织相容性抗原HLA-DR (MHC-II)，以抗鼠IgG1-PE和IgG1-FITC作为同型对照。 原代hUMSCs按比例1:1传代后记作P1代，倒置显微镜下观察细胞形态变化及生长速度，细胞融合达到90%以上时按1:2或1:3比例传代，绘制细胞生长曲线。 取生长状态良好P4代的hUMSCs，分为五组：200μg/ml组、100μg/ml组、50μg/ml组、25μg/ml组和对照组。以3×104/孔的密度接种于5个多聚赖氨酸包被的六孔板中（每个六孔板为一组），待细胞融合达到70-80%时，实验组的四个六孔板分别换为含有200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml黄连素的无血清低糖DMEM/F12培养基的诱导液；对照组六孔板除不加黄连素外，其余均同实验组。倒置显微镜下动态观察细胞形态变化，每12小时一次，连续观察7天，每24h对各组细胞进行免疫细胞化学染色，检测其神经元标志（NSE）、星形胶质细胞标志（GFAP）和神经干细胞标志（Nestin）的表达情况。各组随机选取10个高倍视野，拍照记录计数阳性细胞数及细胞总数，用以计算分化率，结果用均数±标准差来表示。分析不同浓度黄连素诱导hUMSCs的分化率。 结果：原代细胞消化、传代12h后，大部分细胞贴壁，细胞呈三角形、菱形、椭圆形、圆点等形态；随培养时间延长，细胞逐渐变成均一的长梭形，数量增多。培养7-8d时细胞融合可达80%-90%，低倍镜下看到hUMSCs呈放射状、漩涡状排列。按照1:2的比例再传代，连续传至P15代，hUMSCs仍保持旺盛的增殖能力。流式细胞术检测P3、P5和P10代细胞表面分子标记，结果显示各代均表达CD73、CD90和CD105，而不表达CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR。 加入黄连素诱导液后24h，200μg/ml组和100μg/ml组有个别细胞开始发生形态改变，光学显微镜下可见：胞体收缩变圆，折光度增强，伸出指状突起；50μg/ml组、25μg/ml组细胞形态未见明显改变。随着诱导时间延长，细胞胞体进一步收缩，突起增长。36h后部分细胞出现双极突起，以200μg/ml组变化最为明显。48h后200μg/ml、100μg/ml组细胞突起较前更加细长，并可多达2至5条，有的细胞突起逐渐发展成多级，并彼此接触交叉，呈神经样网络样结构；此时，50μg/ml组亦可见到少量细胞胞体收缩、指状突起形成；25μg/ml组则未见明显变化。60h后200μg/ml、100μg/ml组内相临细胞连接形成树突样网络结构更加典型，但200μg/ml组内出现少量细胞脱落、漂浮；50μg/ml组中有突起细胞数较前亦稍有增多；而25μg/ml组仍未见明显变化。72h后各组中有形态变化细胞的数量未见到明显增多。随诱导液的持续作用，分化倾向的细胞表现为越来越典型的神经样形态，同时漂浮、死亡的细胞也在逐渐增多，以200μg/ml组死亡细胞数最多，仅剩少量细胞存活且细胞透亮度降低；100μg/ml、50μg/ml组存活的细胞表现为更为典型的神经细胞样形态：细胞胞质向胞核收缩，胞体折光增强，形成双极、多极突起，突起伸长较前更加明显，可见2、3级突起，有的呈放射状伸展，且直到诱导5天后这些典型神经样细胞开始出现明显脱落、漂浮。免疫细胞化学染色可见大量NSE、GFAP和Nestin阳性表达的神经样细胞，各标志物阳性表达率在不同药物浓度作用下随时间的变化依次为：200μg/ml组NSE（15.0±3.9、81.4±5.8、57.7±7.7、39.1±4.3、25.4±6.8、8.3±4.0、0.0±0.0），GFAP（15.0±4.0、81.3±8.1、56.3±5.6、39.3±5.4、27.1±6.9、8.6±3.2、0.0±0.0），Nestin（14.8±4.0、80.3±7.3、55.9±5.6、38.6±4.9、25.4±6.8、7.9±3.5、0.0±0.0）；100μg/ml组NSE（6.4±3.2、50.4±4.7、87.7±4.6、86.6±5.7、85.2±5.0、64.5±6.6、37.2±5.4），GFAP（6.9±3.7、50.8±5.7、87.5±4.0、87.0±5.9、85.3±4.7、66.1±5.0、38.3±4.9），Nestin（6.3±3.2、50.1±5.0、87.2±4.1、86.6±5.6、84.8±5.3、64.4±6.5、37.3±5.3）；50μg/ml组NSE（0.0±0.0、3.6±2.3、14.3±5.3、13.8±4.4、15.6±6.3、15.8±6.5、15.6±5.7），GFAP（0.0±0.0、3.5±3.0、12.4±6.3、13.8±4.7、15.0±4.2、15.2±5.3、15.1±4.1），Nestin（0.0±0.0、2.8±3.3、12.9±6.5、14.5±5.9、14.9±4.8、15.4±5.6、15.2±5.1）。免疫荧光染色同样呈现GFAP、NSE、Nestin阳性表达；对照组免疫细胞化学和免疫荧光染色均呈阴性。 结论:人脐带经分离纯化可得到表达间充质干细胞表面标志CD73、CD90和CD105，不表达造血干细胞表面标志CD11b、CD19、CD34、CD45和组织相容性抗原HLA-DR （MHC-Ⅱ），具有较高增殖能力，可在体外稳定传代的hUMSCs；黄连素在体外可诱导hUMSCs分化成神经样细胞，并表达神经元标志（NSE）、神经胶质细胞表面标志（GFAP）、神经干细胞标志（Nestin），以黄连素浓度为100μg/ml组最为明显，且存活时间最长。
【关键词】：人脐带间充质干细胞 黄连素 分化 神经样细胞 神经干细胞
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11-12
• 材料与方法12-18
• 结果18-21
• 附图21-34
• 附表34-37
• 讨论37-40
• 结论40-41
• 参考文献41-46
• 综述 中药诱导间充质干细胞向神经样细胞分化的研究46-57
• 参考文献51-57
• 致谢57-58
• 个人简历58

【参考文献】

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本文编号：342426