西藏小型猪糖尿病模型的建立及胰岛细胞分离纯化的研究

发布时间：2017-05-03 02:12

  本文关键词：西藏小型猪糖尿病模型的建立及胰岛细胞分离纯化的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[研究背景] 糖尿病是一组以慢性血葡萄糖(简称血糖)水平增高为特征的代谢疾病群。高血糖是由于胰岛素分泌缺陷和(或)胰岛素作用缺陷引起的。除碳水化合物外,尚有蛋白质、脂肪代谢异常。久病可引起多系统损害,病情严重或应激时可发生急性代谢紊乱。本病使患者生活质量降低,寿命缩短,病死率增高。国际糖尿病联盟(IDF)的最新数据显示,全球糖尿病患者目前已增至3.66亿人,预计在20年内将达到近6亿人。目前,糖尿病的治疗,主要有药物治疗和胰岛素注射治疗,但是无论是药物还是注射胰岛素,都无法彻底根治糖尿病,病人需要终生用药。由于多数病人存在依从性不好的问题,多数糖尿病患者得不到很好的治疗,导致严重并发症的出现。长期服药或者注射胰岛素,不但病人备受疾病的煎熬,而且给病人家庭带来沉重的经济负担,因此,人类社会正积极寻求能够根治糖尿病的方法。胰岛移植被认为是目前治疗糖尿病的有效方法之一。但胰岛来源紧缺,胰岛细胞供体数量不足、免疫排斥反应等,使得治疗效果受到影响。 我国糖尿病病人总数世界第一,异种胰岛移植治疗糖尿病的研究在我国显得更为迫切,但是和国外进行的异种胰岛移植研究相比,我国的异种胰岛移植研究相对落后,至今只有少数几家单位进行过初步的临床实验。国内利用小型猪胰岛细胞异种移植治疗糖尿病的临床前动物实验效果观察和安全性评价数据资料异常缺乏,严重阻碍了临床应用小型猪胰岛细胞异种移植治疗糖尿病的开展。通过本项目的实施可掌握更多异种移植临床前疗效、毒性及安全性评价的资料,为临床异种胰岛移植研究提供坚实的实验基础和理论依据。小型猪作为大动物实验常用实验动物之一,在糖的吸收、转运和利用方面类似于人类,猪的胰岛素与人类的胰岛素只差一个氨基酸,是治疗糖尿病用胰岛素的主要来源,猪胰岛的异种移植也成为人类治疗糖尿病的新方法。并且其常用血液学和血液生化指标的测定值与人类近似,随着年龄的增长,猪可自发动脉粥样硬化,便于人们研究糖尿病及其并发心血管疾病,为糖尿病及其并发症的研究提供理想的动物模型。 [目的] 本研究通过药物诱导的方法建立西藏小型猪糖尿病模型,为了糖尿病研究提供基础资料；通过对胰岛细胞分离纯化,以期获得高质量的胰岛细胞,为小型猪胰岛细胞临床应用提供相关资料和经验。 [方法] 选取健康西藏小型猪10头,单栏饲养,每天按动物体重的3%喂食饲料,自由饮水。小型猪随机分为实验组和对照组,每组各5头。每日观察动物饮食、饮水、行为、精神等状况,每周称量体重一次。小型猪用3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉后,实验组从耳缘静脉推注链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)和四氧嘧啶(Alloxan,ALX)配置的联合药物,连续注射3天,对照组注入等量生理盐水。注射前,两组小型猪禁食12小时(由晚上22点到第二天10点)；注射后,将小型猪饲养在较温暖的环境,维持体温。实验期间每天早晨10点用血糖仪监测小型猪空腹血糖,连续监测7天。造模成功后每周第一天测一次空腹血糖,直到实验结束监测小型猪血糖变化。每周检测糖耐量一次。每次检测前一天晚上22点到当天10点禁食禁水。检测开始后,首先将75克葡萄糖粉溶于350毫升饮用水中喂给小型猪,并于饮完后30分钟、60分钟、120分钟和180分钟分别监测血糖含量。分别在注射前一天和注射结束后第七天采集一次空腹前腔静脉血,分离血清,采用酶法进行甘油三酯、总胆固醇测定,采用试剂盒法进行糖化血红蛋白的测定。 选取健康的7月龄西藏小型猪,安乐死后,无菌条件下摘取西藏小型猪整个胰腺,用4℃预冷的磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline, PBS)浸润,选取胰头部位切割组织块,将表面的被膜、结缔组织和脂肪剔除,PBS冲洗,组织块剪碎后取均分为4组,对比不同质量浓度的胶原酶(1mg/ml,2mg/ml,3mg/ml,4mg/ml)和同一质量浓度不同时间点(0min,15min,30min,45min,60min,75min,90min)分离获得胰岛细胞的数量和效果；使用Ficoll400密度梯度离心、淋巴分离液分离、离心、静置4种方法纯化胰岛细胞悬液,比较最终收集到的胰岛细胞数量和效果；用双硫腙(Dithizone,DTZ)染色计算胰岛细胞的纯度；用吖啶橙/碘化丙啶(Acridine orange/Propidium Iodide, AO/PI)染色计算胰岛细胞存活率。 [结果] 小型猪糖尿病模型制作实验中,实验组药物注射后,第2天即出现高血糖,并连续7天稳定维持在11mmol/L以上,对照组血糖未见明显升高,两组比较差异有显著性意义(P0.05)。实验组糖耐量和糖化血红蛋白检测都有所降低,对照组无明显变化,在糖耐量测试结果中,有两次超过7.0mmol/L即可判定小型猪已患糖尿病,实验组小型猪饮用含糖饮用水后各个时间点血糖水平及空腹血糖均明显高于7.0mmol/L,证明西藏小型猪糖尿病模型成功建立。两组血液总胆固醇和甘油三酯水平均无明显变化,说明STZ联合ALX注射不能引起小型猪血脂变化,故不能用单纯应用STZ联合ALX药物注射的方法制作高血脂动物模型。 胰岛细胞分离纯化确定了不同质量浓度的胶原酶获取胰岛细胞的最佳时间,胶原酶1mg/ml和2mg/ml组为45min,3mg/ml和4mg/ml组为30min,各组在最佳时间点获得胰岛细胞的数量最多的为1mg/ml组,胰岛细胞形态完整,具有活性；4种纯化方法中,收集的胰岛细胞数量由多到少依次为静置组Ficoll400密度梯度离心组离心组淋巴分离液离心组,4种方法获得的胰岛细胞均具有活性。经AO/PI染色后检测胰岛细胞的活度为95%以上。 [结论] 本研究成功对西藏小型猪胰岛细胞进行了分离和纯化的最佳条件进行了摸索和检验,用STZ联合ALX的方法进行西藏小型猪糖尿病模型的建立。上述研究为糖尿病防治提供了新的动物模型和相关实验依据。
【关键词】：西藏小型猪 胰岛细胞 糖尿病 链脲佐菌素
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R587.1;R-332
【目录】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 前言14-29
• 1 糖尿病研究现状14-18
• 2 猪胰岛细胞异种移植治疗糖尿病的研究进展18-20
• 3 小型猪糖尿病模型研究现状20-24
• 4 胰岛细胞移植方法研究24-28
• 5 展望28-29
• 第一章 西藏小型猪糖尿病模型的建立29-49
• 1 材料与方法29-33
• 2 实验结果33-45
• 3 讨论45-49
• 第二章 西藏小型猪胰岛细胞体外分离和纯化方法49-55
• 1 材料与方法49-50
• 2 结果50-53
• 3 讨论53-55
• 全文总结55-56
• 参考文献56-61
• 附录61-63
• 攻读硕士学位期间主要成果63-64
• 致谢64-65

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