优化分枝杆菌重组工程系统构建分枝杆菌突变株筛选方法

发布时间：2021-10-17 00:03

　　目的通过为分枝杆菌重组工程系统（pJV53）加筛选标记,建立一种分枝杆菌突变株的筛选方法。方法为pJV53加入蔗糖反筛选基因SacB和突变的潮霉素抗性基因hyg^S,通过潮霉素抗性恢复指示耻垢分枝杆菌（Ms）体内同源重组的成功,为突变株的筛选提供标记;通过蔗糖反筛选挑选脱去质粒的突变株。结果成功构建重组质粒pJV53-SacB-hyg^S,筛选出MSMEG₄487 G188A突变株以及利福平耐药的Ms rpoB D516Y和Ms rpoB H526Q突变株,并成功将以上突变株脱去质粒。结论 pJV53-SacB-hyg^S能够有效帮助构建筛选突变株,并对突变株进行脱质粒操作,具有普遍应用价值;结核分枝杆菌rpoB基因D516Y和H526Q的突变与该菌对利福平的耐药有关。 

【文章来源】：四川大学学报(医学版). 2019,50(05)北大核心CSCD

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

图１ｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳ构建示意图Ｆｉｇ１ＴｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓｃｈｅｍｅｏｆｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳ．Ｔｈｅｍｕｔａｎｔ

结果２．１ＳａｃＢ扩增和构建ｈｙｇＳＰＣＲ扩增ＳａｃＢ，目的片段大小约１７１６ｂｐ，未见非特异性扩增带，与基因ＳａｃＢ（包括其启动子区）大小一致。重叠延伸ＰＣＲ构建带有终止密码突变的基因片段ｈｙｇＳ，电泳结果显示，目的片段大小约１６２６ｂｐ，未见非特异性扩增带，与潮霉素抗性基因ｈｙｇＲ（包括其启动子区）大小一致，表明上下游片段重叠延伸成功；测序结果显示带有终止密码突变的ｈｙｇＳ构建成功（图２）。图２重叠延伸ＰＣＲ产物ｈｙｇＳ测序结果比对Ｆｉｇ２ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆＳＯＥ－ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｈｙｇＳ２．２构建ｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳ重组质粒重组质粒ｐＪＶ５３－ｈｙｇＳ转化进ＤＨ５α后，筛选出阳性克隆（图３Ａ）；质粒酶切验证，ＳｐｅⅠ共酶切出两条大小约为８８０１ｂｐ、１６２６ｂｐ的条带，分别与ｐＪＶ５３、ｈｙｇＳ大小一致，标志着重组质粒ｐＪＶ５３－ｈｙｇＳ构建成功（图３Ｂ）。以ｐＪＶ５３－ｈｙｇＳ为载体，经酶切和连接得到的重组质粒ｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳ转化进ＤＨ５α后，筛选出阳性克隆（图３Ｃ）；酶切验证，ＸｂａⅠ共切出两条大小约为１０４２７ｂｐ和１７１６ｂｐ的条带，分别与ｐＪＶ５３－ｈｙｇＳ以及ＳａｃＢ大小一致，标志着重组质粒ｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳ构建成功（图３Ｄ）。２．３潮霉素抗性恢复验证及点突变株的

四川大学学报（医学版）第５０卷图３重组质粒ｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳ的构建Ｆｉｇ３ＴｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳＭ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；ＰＣ：Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；ＮＣ：Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；Ｐ１：ＴｈｅｃｏｌｏｎｙＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆｐＪＶ５３－ｈｙｇＳ；Ｐ２：ＴｈｅＳｐｅⅠｄｉｇｅｓｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｏｆｐＪＶ５３－ｈｙｇＳ；Ｐ３：ＴｈｅｃｏｌｏｎｙＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳ；Ｐ４：ＴｈｅＸｂａⅠｄｉｇｅｓｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｏｆｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳ；Ｐ５：ＴｈｅＸｂａⅠｄｉｇｅｓｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｏｆｐＪＶ５３－ＳａｃＢ７Ｈ１０培养基，耐药克隆长出，表明潮霉素抗性标记构建成功。将ＲＩＦ１６、ＲＩＦ２６转化经乙酰胺诱导的Ｍｓ＿ｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳ感受态，涂板含３０μｇ／ｍＬ利福平的７Ｈ１０培养基；将ｏｌｉｇｏ４４８７与ｏｌｉｇｏＨｙｇＲ共转化经乙酰胺诱导的Ｍｓ＿ｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳ感受态，涂板含１００μｇ／ｍＬ潮霉素的７Ｈ１０培养基。耐药克隆突变率见表１。培养基上均长出耐药克隆，测序结果证明（图４），所构建突变成功。２．４ＳａｃＢ的功能验证及突变株反筛选蔗糖反筛选结果显示（图５），Ｍｓ＿ｐＪＶ５３－ＳａｃＢ－ｈｙｇＳ和Ｍｓ＿ｐＪＶ５３在不含蔗


本文编号：3440742