庚型肝炎病毒作为复制型基因治疗载体及小干扰RNA对病毒表达复制抑制作用的研究

发布时间：2021-10-17 06:45

　　第一部分 HGV作为复制型基因治疗载体的实验研究 庚型肝炎病毒（hepatitis G virus，HGV）是单正链的RNA病毒，长约9.4Kb，含一个开放读码框架，编码2900左右的氨基酸。病毒具有细胞亲嗜性，分别存在着淋巴细胞和肝细胞亲嗜株，本室建立的HGV克隆株经初步实验证实其可能是肝细胞亲嗜性的。HGV与HCV同属于黄病毒家族，其基因组结构和复制机理也非常相似。用外源基因neo代替HCV的结构基因区，并插入ECMV IRES直接翻译HCV的非结构基因区，由此建立的HCV亚基因组复制子能够在体外培养细胞中自主持久复制和表达。因此，我们尝试将HGV基因组进行适当改造，用外源报告基因或治疗基因代替HGV的结构基因，并插入筛选标志抗性基因neo，两者间直接用ECMV IRES连接，保留HGV的非结构基因，由此建立HGV亚基因组复制子，研究其在稳定表达HGV结构蛋白的体外培养细胞中的复制、表达和病毒的包装，探索将病毒构建成能自主复制并且具有肝组织靶向性的一类新型载体，以期用于肝病的基因治疗。 1、建立稳定表达HGV结构蛋白的细胞株 以pHGVqz质粒为模板，用PCR方法... 

【文章来源】：中国人民解放军海军军医大学上海市 211工程院校

【文章页数】：131 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

pvAx.EH上游的部分测序结果

约45000和20000处有不同于对照细胞的蛋白条带，大小与HGVEI、E2蛋白接近(图l一8)。用鼠抗HGVEZ的单抗进行WeSternblot实验结果显示，转染细胞在45000大小处有一特异性条带(图1一9)。用HGVRNA阳性血清作为一抗进行we:ternblot实验结果显示，转染细胞在45000大小处有一特异性条带，另外比66000大的地方也有一条不同于对照细胞的条带，应是HGV结构蛋白酶切前的

第二军医大学博士学位论文第一部分第一节中间体(图1一10)。Fig.l一7Assayofthetr出招criPtionol-H行Vstructt叮algenes衍Rl’-PCRmethodMI:DNAM田上erDL15000bP;MZ:DNAM出ternLZ000bp;l:阴性对照;2:未转染HGV结构蛋白Huh7细胞的Rl’-PCR;3:转染了HGV结构蛋白H曲7细胞的Rl:PCR;4:HGV结构蛋白质粒的阳性对照。图1一8.HGV结构蛋白表达的SDS一PAGE电泳Fig.l一8ExPressionofHGVstructuralProteinsbySDS一PAGEM:Prote认M田上er，Middie;l:未转染HGV结构蛋白的Huh7细胞;2:转染HGV结构蛋白的Huh7细胞。图1一9.HGV结构蛋白表达的叭触sternblot(EZMAb)Fig.l一9AssayoftheexPressionofHGVs位ucti叮alProtoinsby叭/estemblotwithHGVEZMAbM，ROteinMarke叽诵ddle;l，Huh一7一EH细胞;2，转染pvAXI.o空载体的Huh一7细胞;3，Huh一7细胞。图1一10.HGV结构蛋白真核表达的叭触stemblot(HGVRNA阳性血清为抗体)Fig.l一10Ass即oftheexPressionofHGVstrueh址a】proteinsbyw匕stemblotwithHGV-positiveserumM:中分子量蛋白Marker;1:转染HGV结构蛋白细胞表达;2:未转染HGV结构蛋白的细胞对照。


本文编号：3441311