蛋白酶Corin在骨髓间充质干细胞分化过程中的作用及机制研究

发布时间：2017-05-04 10:17

  本文关键词：蛋白酶Corin在骨髓间充质干细胞分化过程中的作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：Corin是心脏中发现的一种II型跨膜丝氨酸蛋白酶，在调节血压和维持心脏功能方面起重要作用。除心脏外，corin也表达于其它组织，如肾脏、骨骼组织、妊娠子宫等。最近有研究发现骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）中也有corin表达，为进一步探讨corin在MSCs中的作用，本研究通过检测MSCs分化过程中corin mRNA及蛋白的表达，探讨corin与BM-MSCs分化的关系，为进一步研究蛋白酶corin的功能及其在骨髓间充质干细胞分化中的作用提供依据。 方法： （1）收集正常骨折病人骨髓，采用密度梯度离心法收集含有MSCs的低密度层，获取原代MSCs，采用流式细胞术进行细胞鉴定。 （2）取第三代MSCs，在特定诱导剂的诱导下定向分化为成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞，并通过特异性染色和逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcription PCR，RT-PCR）法进行鉴定。 （3）利用RT-PCR技术对MSCs定向分化过程中corin mRNA的表达进行分析。 （4）利用实时定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测MSCs分化过程中corin mRNA的表达水平，并进行定量分析。 （5）免疫荧光染色检测MSCs成软骨分化中corin蛋白的表达。 结果： （1）我们收集了8例正常骨折病人骨髓，均培养出原代MSCs细胞，细胞原代培养时排列呈螺旋状或漩涡状。传代培养后，细胞基本保持长梭形的形态。流式细胞学检测到细胞表达CD44、CD73、CD90而不表达CD34。 （2）通过茜素红染色、油红O染色、阿尔新蓝染色分别检测BM-MSCs成骨、成脂、成软骨分化的可行性，我们观察到被茜素红染成红色的钙结节，被油红O染成深红色的脂肪小滴，被阿而新蓝染成蓝色的硫酸多聚糖。 （3）通过RT-PCR及qRT-PCR检测到BM-MSCs向成骨、脂肪、成软骨细胞分化过程中均有corin表达，且随着诱导时间的延长，corin的相对表达量逐渐增多（p0.05vs.0d）。 （4）通过qRT-PCR观察到BM-MSCs在成软骨分化4w时corin mRNA表达量最高，我们选取4w时成软骨分化细胞微球，通过免疫荧光染色检测到分化后的BM-MSCs中corin蛋白表达阳性。 结论： （1）原代骨髓间充质干细胞生长旺盛，传代以后纯化度可达90%以上，传至10代以上仍能保持固定的长梭形细胞形态。 （2）BM-MSCs具有很强的多向分化特性，，可作为细胞工程中理想的种子细胞。 （3）在BM-MSCs分化过程中，通过RT-PCR和免疫荧光法均检测到corin的表达，随着诱导时间的延长，corin表达量逐渐增高，说明corin有可能参与了BM-MSC分化过程。 目的：骨性关节炎是中老年人最常见的慢性软骨损伤性疾病之一，其发病机理主要是以软骨慢性磨损为特点。我们前期的研究显示，在BM-MSCs向成软骨细胞分化时，corin表达量显著增高，为研究corin在BM-MSCs向成软骨分化中的作用，我们采用RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术将BM-MSCs中corin mRNA特异性沉默，并观察沉默后的BM-MSCs细胞成软骨能力的改变。 方法： （1）采用磷酸钙沉淀法制备慢病毒，并转导HEK293-corin细胞，用于抑制corinmRNA的表达，通过qRT-PCR和Western blot技术检测干扰效率，并筛选出最优病毒株，用于转导原代培养的BM-MSCs。 （2）细胞迁移实验用于检测corin被抑制后的BM-MSCs迁移能力。 （3）细胞增殖实验检测corin被抑制后的BM-MSCs增殖能力。 （4）免疫组织化学方法检测corin基因被抑制后BM-MSCs成软骨分化能力的变化，并用Image Pro-Plus软件分析IHC图片中阳性染色区域的平均光密度，评价正常BM-MSCs及干扰后BM-MSCs诱导后特异性指标的表达水平。 结果： （1）利用HEK293-corin细胞筛选最佳病毒株，通过qRT-PCR和Western blot技术检测病毒侵染后的HEK293-corin细胞中corin mRNA的表达，发现第V2LHS_12562株病毒沉默效果最好，将这株病毒侵染BM-MSCs发现corin mRNA抑制了80%以上，而对照组corin mRNA仅沉默了5%左右（p0.01vs. siCTRL）。 （2）抑制BM-MSCs中corin mRNA表达对BM-MSCs细胞的迁移及增殖能力均未有显著影响。 （3）抑制BM-MSCs中corin mRNA表达影响了BM-MSCs向成软骨分化，检测软骨特异性的硫酸化多糖和II型胶原蛋白的表达，发现其形成量明显减少，IPP软件分析siCORIN组和siCTRL组中图片蓝色及棕色区域面积，发现其面积均明显减少（硫酸化多糖面积：18.9%vs.60.6%, p0.01; II型胶原蛋白面积：11.4%vs.39.5%, p0.05）。同时通过qRT-PCR法检测软骨特异性基因COL2A1和COMP的表达，发现其表达量也明显降低（*p0.05；**p0.01vs. siCTRL）。 结论： 我们通过RNA干扰技术成功的将BM-MSCs中corin基因沉默，并且corin基因沉默后的BM-MSCs细胞增殖及迁移能力未受明显影响，我们将corin表达下调的BM-MSCs向成软骨细胞诱导，检测软骨特异性蛋白及基因，发现其表达量均降低，这说明corin基因被抑制后，BM-MSCs成软骨分化能力减弱，由此，我们推断出corin参与了BM-MSCs的成软骨分化过程，这为临床疾病如骨关节炎等的治疗提供了一个很好的入口。
【关键词】：Corin 骨髓间充质干细胞 诱导分化 成软骨细胞 染色 Corin 慢病毒 基因沉默 成软骨分化
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 引言11-16
• 参考文献13-16
• 第一部分 骨髓间充质干细胞定向分化过程中 corin 的表达16-32
• 前言16-17
• 材料和方法17-23
• 结果23-29
• 讨论29-30
• 参考文献30-32
• 第二部分 Corin 在 BM-MSCs 成软骨分化过程中的作用研究32-47
• 前言32-33
• 材料与方法33-39
• 结果39-43
• 讨论43-45
• 参考文献45-47
• 结论47-48
• 综述48-57
• 参考文献53-57
• 附件57-59
• 硕士研究生期间发表的论文59-60
• 致谢60-62

【参考文献】

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1 李宁华;;中老年人群骨关节炎的流行病学特征[J];中国临床康复;2005年38期

  本文关键词：蛋白酶Corin在骨髓间充质干细胞分化过程中的作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：344904