NOD8对LPS诱导巨噬细胞释放NO、TNF-α和IL-1β的影响
发布时间：2017-05-04 15:16
本文关键词：NOD8对LPS诱导巨噬细胞释放NO、TNF-α和IL-1β的影响，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：目的： 探讨NOD8对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导巨噬细胞释放一氧化氮（nitric oxide，NO）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis facto-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的影响。 方法： pEGFP-NOD8重组质粒经阳离子聚合物JetPeiR I M E介导转染RAW264.7巨噬细胞，筛选最适pEGFP-NOD8质粒转染浓度；pEGFP-C2空质粒及pEGFP-NOD8质粒分别转染RAW264.7细胞，在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，并检测NOD8蛋白表达情况；在此基础上，将实验设为四组：（1）阴性对照组（negetive control）：新鲜培养基培养RAW264.7巨噬细胞，不做任何处理；（2）pEGFP-C2组：RAW264.7细胞转染pEGFP-C2空质粒24h后，更换为不含LPS的新鲜培养基继续培养；（3）pEGFP-C2+LPS组：pEGFP-C2空质粒转染24h后，更换为含1mg/L脂多糖的新鲜培养基继续培养；（4）pEGFP-NOD8+LPS组：pEGFP-NOD8质粒转染24h后，更换为含1mg/L LPS的新鲜培养基继续培养；随后分别培养RAW264.7巨噬细胞0、6、12、24h，采用Griess reagent法测定不同时间点各组细胞分泌的NO水平；以及ELISA法检测不同时间点各组IL-1β和TNF-α的含量；荧光法测定不同时间点各组caspase-1的活化水平，并采用Western blotting检测不同时间点各组细胞胞浆NF-κB p65亚基蛋白表达情况。 结果: （1）通过MTT检测pEGFP-NOD8质粒不同转染剂量对RAW264.7细胞活力的影响以及pEGFP-NOD8不同转染剂量对LPS诱导RAW264.7细胞NO的释放量的影响确定了3μg/mL质粒转染浓度作为最佳转染剂量；pEGFP-C2空质粒和pEGFP-NOD8质粒分别转染RAW264.7细胞后，，倒置荧光显微镜可观察到绿色荧光，证实转染成功；并进一步通过Western blotting检测NOD8蛋白的表达，结果发现，与pEGFP-C2空质粒转染组相比较，pEGFP-NOD8质粒转染组其NOD8蛋白表达明显增加；（2）与阴性对照组和pEGFP-C2组比较，LPS分别刺激RAW264.7细胞6、12、24h，pEGFP-C2+LPS组随着时间的延长释放NO和IL-1β均明显增加，且呈时间依赖效应；与pEGFP-C2+LPS组相比，pEGFP-NOD8+LPS组在6h NO的释放量无明显变化（P0.05）；但在12h和24h NO的释放显著降低（均P㩳0.01）；而IL-1β于6、12、24h的释放均明显降低（P㩳0.01, P㩳0.05, P㩳0.01）；此外，pEGFP-C2+LPS组细胞上清TNF-α的含量在6h、12h和24h均显著增加；但pEGFP-NOD8+LPS组与pEGFP-C2+LPS组相比，TNF-α的浓度在各时点均无明显变化（P㧐0.05）；（3）LPS刺激RAW264.7细胞6、12、24h，pEGFP-C2+LPS组caspase-1活化水平均明显升高，而与pEGFP-C2+LPS组相比，pEGFP-NOD8+LPS组caspase-1活化水平在各时点均显著下降；（4）pEGFP-C2+LPS组细胞胞浆中的p65的蛋白表达在LPS刺激RAW264.7细胞6、12和24h后逐渐减少；与pEGFP-C2+LPS组相比，pEGFP-NOD8+LPS组胞浆内的p65表达在各时点均明显增加。 结论: （1）pEGFP-NOD8重组质粒成功转入RAW264.7巨噬细胞，NOD8蛋白表达较pEGFP-C2空质粒组明显增加。 （2）在LPS刺激RAW264.7细胞的0、6、12、24h，过表达NOD8在12和24h可抑制LPS诱导的NO释放；并分别于6、12和24h抑制LPS诱导的IL-1β分泌；但对TNF-α的释放量在各时间点则均无明显作用。 （3）过表达NOD8在6、12、24h均可抑制LPS诱导的caspase-1活化以及NF-κB p65亚基的核位移。综上所述，NOD8可抑制LPS诱导巨噬细胞释放NO和IL-1β，其作用机制可能与NOD8抑制caspase-1及NF-κB的活化有关。
【关键词】：RAW264.7 脂多糖 NOD8 NF-κB 一氧化氮 白细胞介素-1β
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：
- 中文摘要3-5
- ABSTRACT5-8
- 前言8-18
- 一、 NLRs家族结构9-11
- 二、 NLRs在识别微生物方面的作用11-12
- 三、 NLRs家族的信号传导12-14
- 四、 NLRs与相关疾病14
- 五、 NOD8的结构和研究进展14-18
- 第一部分 NOD8 重组质粒转染巨噬细胞的效率及 NOD8 蛋白表达18-41
- 材料和方法18-35
- 实验结果35-41
- 第二部分 NOD8 对 LPS 诱导巨噬细胞释放 NO、IL-1Β和 TNF-Α的影响41-49
- 材料和方法41-46
- 实验结果46-49
- 第三部分 NOD8 对 LPS 诱导巨噬细胞 CASPASE-1 活化及 P65 蛋白核位移的影响49-55
- 材料和方法49-53
- 实验结果53-55
- 讨论55-59
- 结论59-60
- 参考文献60-69
- 缩略词表69-72
- 在读期间发表文章72-73
- 致谢73
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 胡巢凤;参与免疫及炎症反应调控的胞浆蛋白NODs[J];中国病理生理杂志;2004年07期
2 王娇莉;徐峰;沈华浩;;NOD蛋白与肺部疾病[J];中国病理生理杂志;2008年10期
本文关键词：NOD8对LPS诱导巨噬细胞释放NO、TNF-α和IL-1β的影响，由笔耕文化传播整理发布。
本文编号：345325
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