抗莪术醇单链抗体的构建及其在大肠杆菌中的表达

发布时间：2017-05-05 21:03

  本文关键词：抗莪术醇单链抗体的构建及其在大肠杆菌中的表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：利用抗体基因工程的方法得到高亲和力的抗莪术醇单链抗体蛋白。 方法：利用RT-PCR及分子克隆的技术，从分泌抗莪术醇单克隆抗体的杂交瘤细胞中克隆编码抗体重链及轻链的基因；利用重叠延伸PCR的方法构建抗莪术醇单链抗体基因，并将该基因克隆到大肠杆菌表达载体中；在细菌中诱导表达抗莪术醇单链抗体，并利用ELISA的方法测定抗莪术醇单链抗体与莪术醇的结合能力。 结果：利用RT-PCR的方法获得了抗体轻链及重链Fab片段基因，并克隆在了T载体中，长度为620bp左右；测序后序列分析表明我们获得的抗体基因为全新的抗体基因，在GeneBank中没有报道。利用重叠延伸PCR的方法将轻链和重链基因的可变区通过多聚甘氨酸接头连接为单链抗体，所得单链抗体基因长度为750bp左右。利用PCR克隆的方法将单链抗体基因３末端加入Flag标签序列，并克隆到细菌表达载体pET21a中得到质粒pET21a ScFvFlag６XHis（pET21ScFvFH），测序结果表明基因表达框正确，没有发生突变。将质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3），利用IPTG诱导2小时后，，Westernblot检测到ScFv的表达，大约有95%的ScFv蛋白存在于包涵体，5%的ScFv蛋白为有活力的可溶性蛋白，分子量为34KD。利用ELISA检测到ScFv蛋白高特异性抗莪术醇活力。 结论：此项研究工作利用基因工程的系列方法，从分泌抗莪术醇的杂交瘤细胞株中成功地构建了抗莪术醇单链抗体基因，并且在细菌中表达出了可溶性单链抗体蛋白，所表达的单链抗体具有高特异性抗莪术醇化合物活力。
【关键词】：ScFv VL VH 大肠杆菌 表达
【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 英汉缩略词对照表9-11
• 前言11-14
• 1 材料与方法14-32
• 1.1 实验材料14
• 1.2 主要实验试剂14-15
• 1.3 主要实验仪器15-16
• 1.4 主要溶液的配制16-17
• 1.5 引物17-19
• 1.6 实验方法19-32
• 2 结果32-39
• 2.1 杂交瘤细胞总 RNA 的提取32
• 2.2 RT-PCR 法扩增编码抗莪术醇抗体基因片段32-33
• 2.3 抗莪术醇抗体轻链及重链基因克隆，测序，序列分析33-34
• 2.4 抗莪术醇 ScFv 的构建34-37
• 2.5 抗莪术醇 ScFv 基因的序列分析37
• 2.6 抗莪术醇 ScFv 在大肠杆菌中表达37-38
• 2.7 抗莪术醇 ScFv 免疫活性检测38-39
• 讨论39-40
• 结论40-41
• 参考文献41-46
• 综述46-58
• 参考文献53-58
• 攻读硕士期间发表的学术论文目录58-59
• 致谢59

【参考文献】

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  本文关键词：抗莪术醇单链抗体的构建及其在大肠杆菌中的表达，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：347064