与胚胎心肌共培养通过Cx43影响ESC源细胞间信号传导的研究

发布时间：2021-11-06 13:10

　　背景：心血管疾病是一类严重威胁人类健康、危及人类生命的疾病。近年来干细胞移植疗法治疗缺血性心肌病成为研究的热点。许多种干细胞或干细胞分化而来的细胞都可作为移植的种子细胞。尽管移植细胞后心肌功能有所改善,但移植细胞的存活率极低,及与宿主细胞间整合不良,可能导致移植后心律失常的发生,远期预后不佳。这仍是一个有待解决的重要问题。目的：研究小鼠胚胎心室肌细胞与小鼠胚胎干细胞之间的相互作用以及共培养对小鼠胚胎干细胞分化细胞间的缝隙连接形成、分布、功能方面的影响。方法：本实验中,我们采用经典的悬滴—悬浮—贴壁法共培养小鼠胚胎干细胞（mES）与小鼠胚胎心室肌细胞（mEVs）,在共培养期间显微镜下观察细胞生长情况、拟胚体（EBs）形态以及EBs的跳动情况；划痕负载染料迁移实验（SLDT）检测细胞间缝隙连接传导功能；从mRNA及蛋白水平研究心肌及缝隙连接相关基因的表达。免疫荧光染色确定连接蛋白的分布情况。从而研究细胞间相互作用以及mES分化而来的心肌细胞的功能。结果：（1）在mEVs与mES细胞的共培养体系中,mES形成的拟胚体自发搏动的比率在分化中期较对照组明显增加；（2）共培养组与对照组间心肌标志物... 

【文章来源】：华中科技大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：90 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
1. 引言
2. 材料和方法
    2.1 技术路线
    2.2 实验材料与试剂
        2.2.1 实验动物
        2.2.2 细胞株
        2.2.3 主要实验试剂
        2.2.4 主要实验设备及耗材
        2.2.5 主要实验试剂的配制
    2.3 实验方法
        2.3.1 细胞的冻存与复苏
        2.3.2 MEF的原代培养
        2.3.3 MEF细胞的传代及丝裂霉素处理
        2.3.4 mES细胞传代
        2.3.5 mES细胞的分化-悬滴法
        2.3.6 mEVs的原代分离培养
        2.3.7 共培养处理
        2.3.8 划痕负载染料迁移实验(SLDT)
        2.3.9 RNA的提取与逆转录
        2.3.10 多聚酶链反应
        2.3.11 蛋白的提取
        2.3.12 BCA法测蛋白浓度
        2.3.13 Western Blot
        2.3.14 免疫荧光染色
        2.3.15 分化细胞的荧光标记
        2.3.16 流式细胞术
        2.3.17 统计学分析
3. 实验结果
    3.1 MEF细胞的形态学观察
    3.2 mES的形态学观察
    3.3 分化细胞的形态学观察
    3.4 EBs跳动比率的观察
    3.5 EBs跳动节律的观察
    3.6 mES分化细胞cTNT的表达
    3.7 细胞的标记示踪
    3.8 流式细胞术检测
    3.9 缝隙连接功能测定
    3.10 Cx43的mRNA表达
    3.11 Cx43的蛋白表达
    3.12 心肌细胞间Cx43的分布
4. 讨论
    4.1 共培养组与对照组均能分化出自发跳动的心肌细胞
    4.2 共培养组与对照组分化心肌细胞数量并无明显差异
    4.3 共培养组分化表达cTNT的细胞是由胚胎干细胞分化而来
    4.4 共培养组分化的心肌细胞间缝隙连接传导功能增强
    4.5 共培养组分化细胞Cx43的表达高于对照组
    4.6 共培养组分化的心肌细胞Cx43规则排列,位于细胞间连接处
5. 结论
6. 工作展望
7. 参考文献
8. 综述
    参考文献
9. 附录
10. 致谢
附录



本文编号：3479895