人体铜转运蛋白1与银离子的结合

发布时间：2017-05-06 19:15

  本文关键词：人体铜转运蛋白1与银离子的结合，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人体铜离子转运蛋白1（hCtr1）含有190个氨基酸，由胞外的N端、三个螺旋跨膜区和胞内的C端区域组成。它在细胞膜内形成三聚体，这种聚集在膜内形成一个锥形的孔道结构。胞外N端包含两个保守的蛋氨酸富集区和两个组氨酸富集区,蛋氨酸富集区以“MXM”和“MMMMXM”的形式存在，第二跨膜区（TM2）位于锥形孔道的内壁，孔道口包含“M150XXXM154”片段。研究表明hCtr1可以传输铜离子和银离子，而这些蛋氨酸片段在金属离子的传输过程中发挥重要的作用。所以研究hCtr1与铜和银离子的结合以及这些蛋氨酸片段在结合过程中所起的作用对了解该转运蛋白的传输机制非常重要。 我们采用圆二色谱、核磁共振波谱和等温滴定量热方法研究了hCtr1第二跨膜区域（hCtr1132-157）及相关蛋氨酸突变体肽与银离子的相互作用。CD实验表明野生型肽段及其各突变体肽段在SDS胶束中都呈α-螺旋结构，加入Ag(Ι)后，肽段的二级结构发生变化，α-螺旋含量有微弱的减小，，证明银与肽段发生结合。NMR实验结果表明，加入银离子后肽段C端残基（包含M150XXXM154片段）的质子化学位移变化较大，而N端残基的质子化学位移几乎不变，这说明银离子与TM2的结合发生在C端区域。银的加入并未引起N端组氨酸残基质子化学位移的变化，说明位于TM2的N端的组氨酸不与银离子结合。 利用ITC实验我们得到了TM2与银离子的结合位点数n、结合常数Ka和结合焓变ΔH，并由计算得到了吉布斯自由能ΔG和熵变ΔS。结果表明，一个TM2在SDS胶束中可以结合3个银离子；当TM2的M150XXXM154片段内M150突变成亮氨酸L后，可以结合2.5个银离子；当M154突变成L后，与一个肽结合的银离子数变成2个；当M150和M154同时替换成L后，得到的肽仍然能与1.5个银离子结合。比较M150L与M154L的结合位点数，我们发现M150与M154在TM2传输离子过程中所起的作用可能不同。此外，我们发现野生型TM2肽有强的自聚集能力，样品配制时不同的前处理方式对ITC实验结果有较大影响。三个突变体肽的ITC实验结果受样品前处理方式的影响较小。 我们还利用圆二色谱法和核磁共振波谱法研究了胞外蛋氨酸富集区相关肽（hCtr134-53，包含M40MMMXM45片段）在SDS胶束（作为膜模拟体系）中的结构与定位以及它与Ag(Ι)的相互作用。结果表明，hCtr134-53肽段的C端区域以α-螺旋结构形式插入胶束内部，而包含MMMMXM片段的N端区域位于胶束表面并与银离子结合。用丙氨酸A逐一替换肽段中的蛋氨酸M，分析了Ag(Ι)与野生型肽和各突变体肽的结合位点，并用ITC实验得到了相应的热力学参数。我们发现野生型肽在SDS胶束表面与Ag(Ι)的结合方式与在水中的结合方式有明显差异。由以上结果我们推断，膜与胞外疏水肽段的相互作用可以使hCtr1胞外部分与Ag(Ι)的结合发生在细胞表面区域，这对银离子在传输孔洞入口处的富集可能起重要作用。 我们的研究结果有助于加深人们对hCtr1的离子传输机理的认识和了解。
【关键词】：人体铜转运蛋白1 银离子 核磁共振 等温滴定量热法 圆二色谱
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3411
【目录】：

• List of Abbreviations4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 绪论12-40
• 1.1 铜转运蛋白家族介绍12-15
• 1.1.1 铜输出蛋白13
• 1.1.2 铜摄入蛋白13-14
• 1.1.3 铜伴侣蛋白14-15
• 1.2 铜转运蛋白 Ctr 的介绍15-20
• 1.2.1 Ctr1 蛋白的结构15-18
• 1.2.2 Ctr1 传输铜离子的机制18-20
• 1.3 生物体内的银离子及 Ctr1 对银离子的传输20-21
• 1.4 研究蛋白质与配体相互作用的方法21-29
• 1.4.1 圆二色谱法21-23
• 1.4.2 核磁共振波谱法23-25
• 1.4.3 等温滴定量热法25-28
• 1.4.4 蛋白的膜模拟环境28-29
• 1.5 本论文的研究思路及其意义29-31
• 参考文献31-40
• 第二章 实验部分40-46
• 2.1 样品和试剂40
• 2.2 样品制备40-42
• 2.2.1 hCtr1-TM2 肽样品的制备40-41
• 2.2.1.1 CD 样品40-41
• 2.2.1.2 NMR 样品41
• 2.2.1.3 ITC 样品41
• 2.2.2 hCtr1-M2 肽样品的制备41-42
• 2.2.2.1 CD 样品41
• 2.2.2.2 NMR 样品41
• 2.2.2.3 ITC 样品41-42
• 2.3 实验参数设置42-45
• 2.3.1 圆二色谱42
• 2.3.2 核磁共振42-43
• 2.3.3 等温滴定量热仪43-45
• 参考文献45-46
• 第三章 人体铜转运蛋白 1 第二跨膜区相关肽与 Ag(I)的相互作用46-72
• 3.1 TM2 与银的相互作用47-54
• 3.2 M20L 与银的相互作用54-57
• 3.3 M24L 与银的相互作用57-60
• 3.4 M20L/M24L 与银的相互作用60-63
• 3.5 肽段与银离子相互作用的影响因素63-70
• 3.5.1 解聚前处理的影响63-68
• 3.5.2 肽段与胶束浓度比值的影响68-70
• 3.6 小结70-71
• 参考文献71-72
• 第四章 人体铜转运蛋白 1 胞外蛋氨酸富集区的结构及与 Ag(I)的相互作用72-87
• 4.1 在 SDS 胶束中的相互作用72-80
• 4.1.1 WT 在 SDS 胶束中的三维空间结构72-74
• 4.1.2 与银的相互作用74-80
• 4.2 在水中的相互作用80-85
• 4.2.1 CD 实验80-81
• 4.2.2 ITC 实验81-85
• 4.3 本章小结85-86
• 参考文献86-87
• 作者简介及科研成果87-88
• 致谢88

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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本文编号：349001